1. Einordnung der Biotechnologie als eine Einführung 2. Der jetzige Stand

1. 1. Einordnung der Biotechnologie als eine Einführung 2. Der jetzige Stand 3. Einige molekularbiologische Grundlagen 4. Biotechnologische Methoden, die man kennen muss! Teil I 5. Was sind Mutanten und wie werden sie erzeugt? 6. Wie macht man gentechnisch veränderte Pflanzen? 7. Biotechnologische Methoden, die man kennen muss! Teil II 8. Umweltaspekte und ethische Erwägungen 9. Biotechnologische Diagnostik 10. Anwendungsbeispiele

2. MARKERDEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN • Lokalisierbarer Unterschied im Genom • zweier Individuen oder Gruppen • Insertion • Deletion • Inversion • Mutation

3. MARKERDEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR)

4. MARKERDEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Wird vom verdauten Genom ausgegangen, so werden nachfolgend auch Unterschiede im Genom erfasst. Damit sind je nach Methode Unterscheidungen und Verwandtschaften nahe oder weit entfernter taxonomischer Gruppen (Art, Klon, Varietät, Linie) im Sinne der Systematik und die Identifizierung und Einordnung von Individuen in Gruppen möglich.

5. MARKERDEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Wird von der isolierten RNA (Transkriptom) ausgegangen, so werden nachfolgend Unterschiede in den unter den gegebenen Bedingungen transkriptierte Gene erfasst. Damit sind endogene oder exogene Einflüsse auf das abgelesene Genprogram qualitativ und quantitativ erfassbar. Anwendung z. B. in der Stressphysiologie (biotisch, abiotisch) und der Entwicklungsphysiologie.

6. MARKERDEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach Ausgangsmaterial 1. Genomische DNA – nach Restriktionsverdau 2. RNA – nach Umschreiben in cDNA Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR)

7. MARKERDEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach der verwendeten Technik 1. Einsatz von Sonden 2. Display-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) Experiment: Genomische DNA wird isoliert (z.B. Arabidopsis, ca. 120 Mbp) und verdaut (z.B. mit EcoR1, Erkennung von 6 Basen G/AATTC). Führt zu etwa 30.000 Restriktionsfragmenten. Die sind auf keinem Gel auflösbar. Es wird nur ein Schmier beobachtet. Was tun ? ( classical quotation)

8. MARKERDEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN Einteilung nach der verwendeten Technik: 1. Einsatz von Sonden 2. Screen-Prinzip (in Verbindung mit selektiver PCR) Entweder „färbt“ man nur einige Banden spezifisch an, dann sind die anderen Fragmente nicht sichtbar. Mittels „sichtbarer“ Sonden erfolgt eine Hybridisierung mit den gewünschten Fragmenten. Oder man amplifiziert einige Banden mit PCR, so dass die anderen einfach als Hintergrund verbleiben. Mittels geeigneter primer werden nur gewünschte Fragmente sichtbar gemacht.

9. MARKER-Typen 1. PHÄNOTYP: meist unbekannte Art von Unterschied 2. RFLP: restriction fragment length polymorphism 3. AFLP: amplified fragment length polymorphism 4. SSLP: simple sequence length polymorphism 5. SSR: simple sequence repeat (Mikrosatellit) 6. SNP: single nucleotide polymorphism 7. CAPS: cleaved amplified polymorphic sequences 8. RAPD: random amplified polymorphic DNA

10. 1. PHÄNOTYP Meist unbekannte Art von Unterschied zwischen Genomen, dessen Konsequenz die veränderte Aktivität eines Gens ist, die sich in der sicht- oder messbaren Veränderung bestimmter Eigenschaften dieser Individuen ausdrückt und nach Mendelschen Regeln vererbt wird ERKENNBAR Blütenfarbe bei Erbsen (Mendel) Normal und zwergwüchsige Erbsen MESSBAR Hypokotyllänge (Phytochrom A Mutante und Wild- typ im Dauerdunkelrot) Antibiotikaresistente Linie gegenüber Wildform unter Selektionsbedingungen

11. 2. RFLP Unterschied im Restriktionsmuster der Genome zweier Individuen Gelanalyse Zusätzliche Restriktionsschnittstelle Diese unterschiedlichen Fragmente können wegen der Vielzahl der Restriktionsfragmente aber nicht „gesehen“ werden.

12. 2. RFLP Mit einer Hybridisierungssonde kann man Mutationen nachweisen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus

13. 2. RFLPDURCHFÜHRUNG • RFLP ist eine Sonden-Technik, auf DNA angewendet • Übertragung der verdauten, genomischen DNA auf dem Gel auf eine Membran = Blotten • Markieren einer „Sonde“, z.B. durch Einbau von radioaktivem 32Phosphor in das Phosphatrückgrat der DNA • Hybridisieren der Membran mit dieser Sonde unter Bedingungen, bei denen sich die Sonde nur an basenkomplementäre Fragmente anlagert • Autoradiographie der Membran. Der Film (die Platte des Phosphoimagers) wird nur dort geschwärzt, wo sich die Radioaktivi-tät befindet. Man erhält das vorher dargestellte Gelbild

14. 2. RFLPSONDE Sonde = DNA-Fragment aus einem Bereich des Genoms der den Polymorphismus überdeckt oder an diesen angrenzt Autoradiogramm

15. 2. RFLPSONDE Sonde = DNA-Fragment aus einem Bereich des Genoms der den Polymorphismus überdeckt oder an diesen angrenzt Autoradiogramm

16. 2. RFLP Mit dem RFLP-Marker können wir den Genotyp bestimmen

17. 2. RFLPERSTELLUNG • Klonierung eines beliebigen (genomischen) Fragments = Sonde • Restriktionsverdau genomischer DNA der beiden Individuen mit einem identischen Satz von Restriktionsenzymen • Gelelektrophorese und Blotten der verdauten DNAs • Hybridisierung des Blots mit der radioaktiv markierten Sonde • Autoradiographie und Identifizierung eines Restriktionsverdaus, der einen Poly-morphismus zeigt

18. 2. RFLPPROBLEME • Große pflanzliche Genome besitzen einen hohen Anteil repetitiver DNA, d.h. es ist schwierig DNA Fragmente zu klonieren, die nur mit einem Locus des Genoms hybridisieren • Züchterisch eingesetzte Varietäten von Kulturpflanzen sind häufig sehr nahe miteinander verwandt, d.h. die Zahl der polymorphen Loci ist gering, so dass eine große Zahl von Enzymen und/oder Sonden getestet werden muss • Die Analysentechnik ist zwar robust und gut reproduzierbar, aber teuer und aufwendig.

19. 3. AFLPamplified fragment length polymorphism Display-Verfahren, auf DNA und RNA anwendbar • Grundsätzlich: Unterschied im Restriktionsmuster der • Genome zweier Individuen werden ausgenutzt • IM GEGENSATZ ZUM RFLP • werden Restriktionsenzyme eingesetzt, die neben 6 auch nur 4 bp erkennen, d.h. die durchschnittliche Fragmentlänge sinkt von ca. 4000 auf etwa 250 bp. Statt Agarosegelen werden Polyacrylamidgele Elektrophorese eingesetzt. • wird statt der „Sonden-Technik“ das „Display“-Prinzip verwendet, d.h. statt aller möglichen Restriktionsfragmente (16x mehr als beim RFLP) wird durch ein entsprechendes Verfahren nur eine Teilmenge der Fragmente erzeugt, deren Zahl sich bei der Gelelektrophorese gerade noch auftrennen lässt. Aus diesem Grund wird keine Sonde benötigt.

20. 3. AFLP

21. 3. AFLP „SPEZIFISCHE PCR“ PCR Primer 1 <——— AC GACGT GATT.. ....TGTC TAA NNNNN.....NNNNN CTGCA CTAA.. ..ACAG ATT NNNNN.....NNNNN GACGT GATT.. TGTC TAA TC ———> PCR Primer 2 [MseI] [PstI]

22. 3. AFLP „SPEZIFISCHE PCR“ Über- Anteil Genom Pflanze hang ampl. 106 bp 1 1/4 2 Bakterien 2 1/16 8 Bakterien 3 1/64 32 Hefe 4 1/256 128 Arabidopsis 5 1/1024 512 Reis 6 1/4096 2048 Zuckerrübe 7 1/16384 8192 Gerste 8 1/65536 32768 Weizen

23. 3. AFLP VORTEIL Robustes, reproduzierbares Verfahren, das wegen der hohen Zahl amplifizierter Fragmente meist mehrere polymorphe Banden in einem Experiment liefert. Kann an einen weiten Bereich von Genomgrößen angepasst werden. NACHTEIL 1. DNA-AFLP: Banden (Merkmale) sind kaum Genen zuzuordnen 2. cDNA-AFLP: komplexe und teure Prozedur

24. 4. SSLPsimple sequence length polymorphism - PCR-gestützte Markertechnik (display-Technik) - Zu untersuchende Bereich wird mit sequenz-spezifischen primern überdeckt und mittels PCR amplifiziert - Die enstehenden Fragmente werden mit Agarose-Gel-Elektrophorese in Gegenwart von Ethidiumbromid nach Größe aufgetrennt und verglichen.

25. 4. SSLP Primer I Primer II Primer I Primer II Insertion (Analog Deletion) Autoradiogramm

26. 4. SSLP Einschätzung - Bei entsprechenden Vorkenntnissen (Gensequenz bekannt, ein locus für die Insertion kann vermutet werden) sehr effektiv. - Beschränkt auf Mutationen, die die Sequenzlänge zwischen den primern verändert. - CAPS wird oft bevorzugt.

27. 5. SSRsimple sequence length polymorphism Unterschiedliche Zahl von Wiederholungen einfacher Di- und Trinukeotidsequenzen (TG)10 (TG)12 ENTSTEHUNG „Stottern“ der Polymerase bei der Replikation VORTEIL Schnelle Veränderung der Anzahl von Wiederholungen solcher Sequenzen in evolutionär kurzen Zeiträumen, d.h. auch Nutzpflanzenvarietäten zeigen noch Polymorphie

28. 5. SSR IDENTIFIZIERUNG Amplifikation kurzer genomischer Fragmente, die den SSR enthalten und anschließender Vergleich der Fragmentlängen auf hochauflösenden Polyacrylamidgelen analog zur DNA-Sequenzierung. Folglich: Display-Technik, üblicherweise mit DNA

29. 5. SSRIDENTIFIZIERUNG • Anlegen einer Bibliothek kurzer genomischer Fragmente in E. coli Plasmiden • Übertragen der Kolonien auf Nylonmembranen • Hybridisieren mit SSR-Oligonukleotiden, wobei selbstkomplementäre Sequenzen ([CG]n und [AT]n) ausgeschlossen sind • Sequenzieren positiver Klone • Design und Synthese von PCR-Primern • Überprüfen, ob Polymorphie des amplifizierten Fragmentes für die interssierenden Varietäten vorliegt

30. 5. SSRIDENTIFIZIERUNG • Alternativ • Sequenzierung willkürlicher Genomabschnitte oder cDNA-Klone; dann weiter mit 5. und 6. • Vergleichende Sequenzierung „identischer“ Genomabschnitte oder cDNA-Klone aus unterschiedlichen Varietäten

31. 6. SNPsingle nucleotide polymorphism Unterschied in einem einzigen Basenpaar A C VORTEIL SNPs sind häufig auch zwischen nahe verwandten Individuen (im Humangenom ca. 0,1% aller Basenpaare)

32. 6. SNP IDENTIFIZIERUNG Vergleichende Sequenzierung „identischer“ Genomabschnitte oder cDNA-Klone ANALYSE Sequenzierung von amplifizierten Fragmenten Hybridisierung von Oligonukleotiden, die den SNP berdecken, mit präamplifizierten genomischen Fragmenten

33. 6. SNP Fluorescence resonance energy trasfer (FRET) Temperaturabhängigkeit

34. 6. SNP Fluorescence resonance energy trasfer (FRET) Temperaturabhängigkeit

35. B A C

36. 7. CAPSCleaved amplified polymorphic sequences - Ähnlichkeit mit SSLP, ebenfalls PCR-gestützt (= Display-Technik) - Keine Sonde, sondern Ethidiumbromid-Färbung nach PCR - Das PCR-Propdukt wird zusätzlich mit Restriktionsenzymen verdaut and nach Längenpolymorphismen mit Agarose-Gelelektrophorese untersucht.

37. 7. CAPSCleaved amplified polymorphic sequences primer A C Genom 1 Genom 2 neue Schnittstelle Genom 2 Genom 1 1. PCR-Amplifizierung 2. Restriktionsverdau 3. Gelelektrophorese Gelektrophorese

38. 8. RAPDrandom amplified polymorphic DNA Unterschiede bei der Bindung von Oligonukleotiden willkürlicher Sequenz und der daraus resultierenden unterschiedlichen Amplifizierbarkeit kurzer genomischer Fragmente Genom Individuum 1 Genom Individuum 2 Gelanalyse

39. 8. RAPD

40. 8. RAPD VORTEIL Nur geringe Vorarbeiten bzw. Vorinformationen erforderlich (Präparation genomischer DNA und Test der PCR-Primer)

41. 8. RAPD NACHTEIL Geringe Reproduzierbarkeit, da die Amplifikation von Fragmenten unter Bedingungen stattfinden muss, bei denen die primer an Sequenzen der genomischen DNA binden, die nicht vollständig basenkomplementär sind. Das führt zu starken Abhängigkeiten von den Anfangsbedingungen (Konzentration und Reinheit der Komponenten) und den Versuchsablauf (Genauigkeit und Geschwindigkeit der Temperatureinstellung).

42. Das war schon alles zu den Markern!

43. 2. Diagnostik und Pflanzenschutz - Viroide - Viren - Bakterien - Pilze

44. Molekulare Diagnostik und Pflanzenschutz 1. Nachweis der Pathogenfreiheit für kommerzielle Zwecke 2. Absicherung der Pathogenfreiheit im Ausgangsmaterial für Züchtungszwecke 3. Allgemeine phytosanitäre Überwachung Ökonomische Aspekte der Methodenwahl 1. Zeitaufwand, besonders Lohnkosten 2. Automatisierbarkeit 3. Materialkosten

45. 1. Viroide Ein Viroid ist ein infektiöses Molekül, das aus einer einzelsträngigen, zirkulären (nur 150–400 Nukleotide) RNA besteht. Dem Viroid fehlt vor allem die Proteinhülle eines normalen Virus. Viroide kommen in der Natur als Krankheitserreger von Pflanzen vor (Pflanzenpathogen). Im Gegensatz zu Viren tragen Viroide keine Gene. Sie codieren also keine Proteine, weshalb Viroide bei ihrer Replikation und ihrem Transport ausschließlich auf Enzyme der Wirtspflanzen angewiesen sind. Der Infektionsmechanismus der Viroide ist bisher unklar. Allerdings wurden Nukleotidsequenzen in der Wirtspflanzen-DNA gefunden, die komplementär zu den Sequenzen der Viroide sind. Hierbei wäre also denkbar, dass das Viroid selbst als primärer Pathogenitäts-Effektor wirkt. Alternativ wird diskutiert, dass Viroide ihre Pathogenität durch "RNA silencing" erlangen.

46. 1. Viroide Die meisten Viroide tauchen in Kulturpflanzungen auf bzw. sind dort am meisten verbreitet. Ein gutes Beispiel ist das Kartoffelspindelknollen-Viroid (Abk. PSTVd), welches Kartoffeln, Tomaten und viele andere Pflanzenarten befällt und großen wirtschaftlichen Schaden anrichtet.

47. 1. Viroide Molekulare Nachweismöglichkeit: - Bereits 1981 wurde Viroid-RNA (als cDNA) in einem Vektor kloniert und nach radioaktiver Markierung als Hybridisierungssonde verwendet. - Ursprünglich hat die Notwendigkeit der radioaktiven Markierung die Anwendung in breitem Massstab verhindert. - Heute ist nicht-radiokative Markierung kein Problem mehr, der finan- zielle Aufwand hat solche und ähnliche Methoden bisher jedoch nicht zum Einsatz kommen lassen.

48. 1. Viroide Praktische Nachweismöglichkeit: bidirektionale Elektrophorese Largely internally base-paired viroid RNA denat. nativ

49. 1. Viroide Bidirektionale Gelektrophorese mit nachfolgender Silberfärbung hat dieselbe Empfindlichkeit wie Hybridisierungstechniken (5 ng/ g Frischgewicht), ist jedoch wesentlich billiger. Außerdem braucht man nicht jedesmal eine neue Sonde, wenn Ein anderes Viroid zu bestimmen ist.

50. 2. Viren Hybridisierungstechniken sind möglich, auch PCR-gestützte Methoden sind beschrieben und werden in der Forschung verwendet. In den Großtests jedoch sind diese Methoden zu teuer. Ein Testverfahren, dass von den Hüllproteinen der Viren Gebrauch macht, wird hingegen wegen der geringen Kosten im Routinetest eingesetzt.