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FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche

FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche. Clonaggio, espressione e purificazione della MAP chinasi 7 di Arabidopsis thaliana Candidato: Camilla Badiali 1470854 Relatore: Dott.ssa Maria Rosaria Fullone Anno accademico 2013/2014.

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Presentation Transcript

  1. FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALICorso di Laurea triennale in Scienze Biologiche Clonaggio, espressione e purificazione della MAP chinasi 7 di Arabidopsisthaliana Candidato: Camilla Badiali 1470854 Relatore: Dott.ssa Maria Rosaria Fullone Anno accademico 2013/2014

  2. COSA SONO LE Mitogen-ActivatedProteinKinase? • Sono presenti in tutti gli eucarioti (animali, piante e funghi) • Sono chinasi serina/treonina prolina-dirette che fosforilano substrati contenenti il motivo consenso YX [S/T] P, dove Y rappresenta una prolina o un amminoacido alifatico • Cascate di MAPK mediano la trasmissione e l'amplificazione degli stimoli extracellulari • Quando la risposta deve essere interrotta le MAPK sono defosforilate e quindi disattivate da fosfatasi MKKK

  3. LE MAPK NELLE PIANTE Nelle piante le cascate di MAPK e più in generale i sistemi basati sulla fosforilazione/defosforilazione sono molto importanti per la risposta rapida ai cambiamenti dell’ambiente esterno • Circa il 10 % di tutte le chinasi vegetali è coinvolto in cascate di MAPK • In Arabidopsisthalianala sequenza del genoma ha rivelato l’esistenza di 23 geni che codificano per MAPK e 10 per le MAPKK • Le MAPK vegetali sono coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare, nella risposta a stress abiotici, nella risposta a ormoni e all’attacco patogeno

  4. MPK7 di Arabidopsisthaliana • Appartiene ad una cascata di MAPK coinvolta nella risposta ai patogeni in Arabidopsisthaliana • È attivata dalla MAP chinasichinasi 3 (MKK3) • Interagisce con la 14-3-3 omega, come evidenziato in un lavoro di proteomica(Chang et al., 2009)

  5. COSA SONO LE PROTEINE 14-3-3? • Sono proteine dimeriche leganti fosfoserina o fosfotreonina che regolano le attività di una vasta gamma di target tramite interazione diretta proteina-proteina • L’interazione con i loro bersagli è promossa dalla fosforilazione della sequenza consenso sulla proteina bersaglio; le sequenze consenso sono di tre tipi: -modo 1 (K/RXXSp/TpXP) -modo 2 (K/RXXXSp/TpXP) -modo 3 (YTpV) (dove X rappresenta qualsiasi amminoacido mentre la Sp/Tp sono serina o treonina fosforilate) • Sono proteine regolatrici ubiquitarie degli organismi eucarioti che hanno un ruolo nella regolazione del ciclo cellulare, differenziamento, apoptosi e il coordinamento di molteplici vie di trasduzione del segnale

  6. OBIETTIVO L’obiettivo di questo lavoro era verificare in vitro l’interazione tra MPK7 e 14-3-3 omega

  7. INTERAZIONE in vitro DI MPK6 DI MAIS CON 14-3-3 In vitro: è stato dimostrato che la MAP chinasi 6 di mais, ZmMPK6, è in grado di interagire con le proteine 14-3-3: Il saggio di overlay, utilizzando come sonda una 14-3-3 marcata con 32P, ha mostrato una dipendenza dell’interazione dalla fosforilazione Il pull down assayha dimostrato l’interazione tra la MPK6-Hisx6 e la GST-14-3-3 immobilizzata su resina di glutatione-sefarosio-4B (Lalle et al., 2005)

  8. CLONAGGIO DELLA MPK7 Il frammento di DNA codificante la MPK7 è stato: • Amplificato mediante PCR a partire da una preparazione di cDNA totale ottenuta per retrotrascrizione con oligodT da RNA totale diArabidopsisthaliana • Estratto dal gel di agarosio • Clonato in pGEM-T • Sequenziato • Il plasmide pGEMT-mpk7 è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e XhoI • Il frammento di cDNA ottenuto è stato clonato nel vettore di espressione pGEX-6P-1 precedentemente digerito con gli stessi enzimi • Il costrutto pGEX-6P-1-mpk7 è stato trasferito nel ceppo BL21 (DE3) Il plasmide pGEX-6P-1 permette l’espressione di proteine ricombinanti fuse alla GST mpk7

  9. ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DELLA MPK7 GST-MPK7 97 kDa • Per trovare le condizioni sperimentali migliori, l’induzione della coltura con IPTG è stata condotta a diverse temperature e la migliore si è rivelata essere 30 °C • La coltura è stata sonicata ed è stato eseguito un western blottingcon anticorpi anti-GST del lisato cellulare per verificare la quantità di GST-MPK7 presente 85 kDa 66 kDa 50 kDa GST-MPK7 35kDa 30 kDa • La proteina solubile ottenuta in queste condizioni è purificata attraverso cromatografia di affinità su una resina di glutatione-sefarosio-4B e analizzata su gel di poliacrilammide 25 kDa GST 21 kDa Induzione a 30 °C Induzione a 16 °C Induzione a 37 °C

  10. DIGESTIONE DELLA PROTEINA DI FUSIONE GST-MPK7 • la chinasi ricombinante viene digerita utilizzando la proteasi PreScissionche riconosce una specifica sequenza e separa la GST dalla MPK7 97 kDa 66 kDa GST-MPK7 45 kDa MPK7 30kDa GST 21 kDa

  11. ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DELLA 14-3-3ω-Hisx6 • L’espressione della proteina 14-3-3ω-Hisx6 è stata indotta a 30 °C con IPTG • La coltura viene sonicata • Il lisato cellulare viene purificato attraverso una cromatografia d’affinità su resina contenente cobalto • La proteina purificata è sottoposta a corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide 97 kDa 66 kDa 45 kDa 14-3-3ω-Hisx6 30 kDa 21kDa

  12. L’INTERAZIONE TRA MPK7 E LA 14-3-3 OMEGA MPK7 possiede una sequenza consenso fosforilabile T E Y che deve essere fosforilata perché si attivi MPK7 presenta una sequenza consenso per il legame con la proteina 14-3-3 omega R F I K S L P

  13. Studio di interazione in vitro della MPK7 con la14-3-3ω-Hisx6 : saggio di overlay Il saggio di overlayè una tecnica che consiste in una parziale modificazione del western blotting I campioni proteici (MPK7) da analizzare sono: • separati mediante elettroforesi in gel di poliacrilammide • trasferiti su membrana di nitrocellulosa • incubati con la 14-3-3ω-Hisx6 utilizzata come sonda • incubati con anticorpi anti-poliHis per rivelare l’avvenuta interazione

  14. CONCLUSIONIIl risultato ottenuto non ha dato un esito che permette di confermare con sicurezza l’interazione tra la MPK7 e la 14-3-3ω-Hisx6 72 kDa È possibile osservare una banda d’interazione tra la 14-3-3ω-Hisx6 e una proteina presente sulla membrana di nitrocellulosa nelle linee contenenti i campioni di GST-MPK7 e GST-MPK7 digerito con proteasi PreScission entrambi fosforilati, mentre non si osserva alcuna interazione con la GST-MPK7 non fosforilata. L’incertezza del risultato risiede nel fatto che la banda evidenziata nel risultato del saggio non possiede il peso atteso di 70 kDa(GST-MPK7) o 40 kDa(MPK7) ma ha un peso inferiore pari a circa 35 kDa. 14-3-3ω-Hisx6 e..? 35kDa 26kDa GST-MPK7 fosforilata GST-MPK7 digerita e fosforilata GST-MPK7 non fosforilata

  15. CONCLUSIONI La nostra ipotesi è che la proteina con cui la 14-3-3 ha interagito: • Non sia MPK7 • MPK7 parzialmente degradata Per validare il risultato si potrebbe: • Utilizzare una sonda più sensibile (14-3-3 marcata con 32P) • Effettuare un pull down assay • Verificare l’attività di MPK7 • Studiare l’interazione in un organismo eucariotico

  16. LE MAPK INTERAGISCONO CON LE 14-3-3 SIA in vivo CHE in vitro In vivo: è stata dimostrata un’interazione tra la 14-3-3 omega e la MPK7 attraverso uno studio di proteomica La 14-3-3 omega è stata: • Ingegnerizzata con una con una TAP tag “tandem affinitypurificationtag” che conteneva le sequenze codificanti per la proteina A e un peptide esaistidinico • Espressa in Arabidopsisthaliana I complessi proteici formati da 14-3-3 e le sue proteine target sono stati: • Purificati mediante due successive cromatografie di affinità - IgGsefarosio - Ni-NTA sefarosio • Separati tramite elettroforesi bidimensionale • Digeriti con tripsina I peptidi sono poi identificati tramite spettrometria di massa

  17. LE MAPK INTERAGISCONO CON LE 14-3-3 SIA in vivo CHE in vitro In vitro: è stato dimostrato che la MAP chinasi 6 di mais, ZmMPK6, è in grado di interagire con le proteine 14-3-3 attraverso saggio di overlay e pull down assay. • SAGGIO DI OVERLAY • La proteina 14-3-3 è stata: • Espressa nel vettore pGEX-2T-K contenente una sequenza codificante per la GST e una sequenza consenso fosforilabile per la PKA (ProteinKinasi A) • Fosforilata con ATP marcato con 32P • Usata come sonda in saggi di overlay • PULL DOWN ASSAY • MPK6-Hisx6 è stata: • incubata con una resina contenente glutatione-sefarosio-4B su cui era stata immobilizzata la GST-14-3-3 • Eluita con glutatione • Analizzata in western blotting

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