École doctorale Sciences de la Vie et de la Santé, Université Aix-Marseille II

1. Journée des doctorants – 17 déc 04 Confinement moléculaire et organisation de la membrane des cellules vivantes: analyse de la diffusion par spectroscopie de corrélation de fluorescence Laure WAWREZINIECK École doctorale Sciences de la Vie et de la Santé, Université Aix-Marseille II Spécialité: Biologie des eucaryotes, option Immunologie Sous la direction de: Didier MARGUET, Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy Université Aix-Marseille II – CNRS – INSERM Pierre-François LENNE, Institut Fresnel Université Aix-Marseille III – CNRS bourse MENRT Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy

2. Engelman, Nature, 2005 • la membrane cellulaire: une structure très complexe! • organisation dynamique: étude de la diffusion • différentes méthodes sont possibles: Suivi de particules uniques (SPT) Recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

3. Modèles d’organisation compartimentée de la membrane cellulaire • Un outil pour étudier la diffusion moléculaire: la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) • FCS à rayon variable et lois de diffusion FCS • Wawrezinieck et al, SPIE, 2004 • Wawrezinieck et al., Biophys J, 2005 • Lois de diffusion FCS mesurées dans les cellules vivantes COS-7 et nature du confinement membranaire • Lenne et al, EMBO J, 2006 • Étude préliminaire de la réorganisation membranaire au cours de l’activation cellulaire

4. Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles d’organisation tiré de Singer & Nicolson, 1972

5. Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles d’organisation animation réalisée par l’équipe d’A. Kusumi

6. tiré de Jacobson et al., 1995 Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles d’organisation animation réalisée par l’équipe d’A. Kusumi mise en contact rapide des différents acteurs d’une réaction  organisation non aléatoire et non uniforme de la membrane

7. 0,2 µm 50 µm Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Structure du réseau de microfilaments d’actine Image obtenue par microscopie confocale de fluorescence de cellules CEF après marquage par rhodamine-phalloïdine Wakatsuki et al., 2001 Image obtenue par microscopie électronique dans un lamellipode de fibroblaste REF-52 Svitkina et al., 1987

8. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Le réseau des microfilaments d’actine: un obstacle à la diffusion des protéines transmembranaires récepteur à la transferrine (TfR) équipe de Kusumi Expériences de suivi de particules uniques par l’équipe de Kusumi (cellules NRK): confinement transitoire des protéines TfR dans les mailles du réseau d’actine: taille des mailles: 260 nm temps moyen de confinement: 55 ms Fujiwara et al., 2002

9. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les protéines ancrées au cytosquelette: un obstacle à la diffusion des phospholipides équipe de Kusumi Expériences de suivi de particules uniques par l’équipe de Kusumi (cellules NRK): confinement transitoire des phospholipides DOPE : taille des mailles: 230 nm temps moyen de confinement: 11 ms Fujiwara et al., 2002

10. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts”

11. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts”  pas d’observation directe (structures trop petites et trop nombreuses) « membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)

12. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts” • Une définition biochimique: • fractions de membranes résistantes à l’extraction par des détergents non-ioniques tels que le TritonX-100 à 4°C (ou le Brij 98 à 37°C) • microdomaines enrichis en sphingolipides, cholestérol et certaines protéines hors rafts dans rafts GFP-GPI « membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)

13. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou “lipid rafts” • Vers une définition physique ? • utilisation des propriétés de diffusion différentes en présence et en l’absence de microdomaines • mesure de la diffusion par des méthodes optiques « membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)

14. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation La FCS: montage de microscopie de fluorescence photodiode à avalanches autocorrélation filtre trou confocal I(t) laser miroir dichroïque volume confocal objectif de microscope échantillon

15. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas d’une molécule unique Intensité de fluorescence I(t) fluctuation de fluorescence temps t Fonction d’autocorrélation:

16. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas d’une molécule unique Intensité de fluorescence I(t) fluctuation de fluorescence temps t =1+ Fonction d’autocorrélation: délai t = 1 + aire relative de recouvrement copies I(t+t) I(t) Intensité de fluorescence I(t) recouvrement temps t

17. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas d’une molécule unique Intensité de fluorescence I(t) fluctuation de fluorescence temps t =1+ Fonction d’autocorrélation: délai t = 1 + aire relative de recouvrement copies I(t+t) I(t) Intensité de fluorescence I(t) aire relative de recouvrement recouvrement délai t temps t

18. Intensité de fluorescence (kHz) 350 300 0 10 20 30 40 50 60 temps t (s) 1.4 1.3 fonction d’autocorrélation g(2)(τ) 1.2 temps de diffusion dans le volume confocal 1.1 1 101 102 103 104 105 délai τ(ms) Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas de plusieurs molécules

19. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Utilisation de la FCS pour l’étude de la diffusion La FCS traditionnelle: temps de diffusion

20. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire? La FCS à rayon variable: temps de diffusionτd aire du spot w2

21. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire? La FCS à rayon variable: temps de diffusionτd aire du spot w2

22. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire? La FCS à rayon variable: temps de diffusionτd aire du spot w2

23. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire? La FCS à rayon variable: temps de diffusionτd aire du spot w2 ‘Loi de diffusion FCS’

24. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment obtenir de nouvelles informations sur l’organisation membranaire? La FCS à rayon variable: temps de diffusionτd temps de diffusionτd aire du spot w2 aire du spot w2 ‘Loi de diffusion FCS’

25. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation La FCS à différentes échelles spatiales Le diamètre du spot peut être réglé entre 0,4 et 1,0 µm

26. volume confocal noyau z lamelle y 30 μm x cellule COS-7 Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Mesures de FCS réalisées sur les cellules COS-7 20 selon axe z 15 position (µm) 10 5 0 20 40 60 80 100x103 intensité détectée (cps)

27. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Analogues lipidiques fluorescents et protéines de fusion utilisées dans les cellules COS-7 • glycérophospholipides: FL-PC et FL-PE • sphingolipides: FL-SM et FL-GM1 • protéines ancrées GPI: GPI-GFP et Thy1-GFP • protéines transmembranaires: GFP-TfR et GFP-DPPIV

28. diffusion libre 2D τdiff Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Mesures de FCS réalisées sur les cellules COS-7: étude de l’autocorrélogramme 1.20 FL-GM1 GFP-TfR 1.08 1.15 1.06 fonction d’autocorrélation fonction d’autocorrélation 1.10 1.04 1.05 1.02 1.00 1.00 0.001 0.1 10 1000 0.001 0.1 10 1000 délai (ms) délai (ms) L’étude à une seule taille de volume confocal ne permet pas de conclure quant au type de diffusion

29. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS mesurées sur les cellules COS-7 FL-GM1 100 GFP-TfR 80 60 temps de diffusion (ms) 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 -20 2 3 2 waist (x10 nm )  Quels types d’organisation de la membrane permettent d’expliquer de telles lois de diffusion?

30. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: modèles de diffusion diffusion libre temps de diffusion aire du spot - w2 domaines isolés réseau partage dynamique obstacles imperméables

31. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: paramètres Modèle des domaines isolés Modèle de réseau w P Pout Din Pin Dmicro Dout 2r r

32. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: paramètres Temps de confinement (τconf ): temps moyen mis par une molécule placée au centre du domaine pour en sortir P r Force de confinement(Sconf ): avec : P : probabilité de sortie d’un domaine r : rayon du domaine : longueur moyenne du pas élémentaire tdiff : temps de diffusion à travers le domaine A : constante

33. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations du réseau: résultats

34. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations du réseau: résultats Grandes tailles de spots confocaux si Xc2>2:

35. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations des domaines isolés: résultats

36. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations des domaines isolés: résultats si Xc2>10: Grandes tailles de spots confocaux a: coefficient de partage t0: indice de confinement

37. Aires accessibles Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: résumé des résultats réseau domaines isolés obstacles imperméables diffusion libre obstacles imperméables t0 = 0 diffusion libre t0 = 0 temps de diffusion 0 Aire du spot confocal domaines isolés t0 > 0 réseau t0 < 0

38. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Glycérophospholipides/Protéines ancrées GPI/Sphingolipides FL-PC: glycérophospholipide GFP-GPI: protéine ancrée GPI FL-GM1: sphingolipide

39. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Modification enzymatique de la membrane cholestérol oxydase sphingomyélinase sphingomyéline

40. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation 50 40 30 temps de diffusion (ms) 20 FL-GM1 10 + COase 1U/mL + SMase 0.1 U/mL 0 3 0 40 80 120x10 2 2 waist (nm ) Analogues lipidiques fluorescents: traitements enzymatiques sans traitement

41. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques mais pas dans les mailles du cytosquelette modif actine modif radeaux lipidiques

42. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques Cyto D Les glycérophospholipides, sphingolipides et protéines ancrées GFP ne sont pas sensibles au confinement par le réseau d’actine

43. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR control

44. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR control

45. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR control + cytochalasine D (2 μM)

46. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: l’exemple de TfR control + cytochalasine D (2 μM) + cytochalasine D (10 μM)

47. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques et/ou les mailles du cytosquelette modif actine modif radeaux lipidiques modif actine + modif radeaux lipidiques

48. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire des protéines transmembranaires dans les radeaux lipidiques et dans les mailles du réseau d’actine Cyto D Cyto D

49. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques et/ou dans les mailles du réseau d’actine caractéristiques des mailles du réseau d’actine: caractéristiques des domaines isolés: • taille des mailles: 2r = 240 ± 60 nm • tconf de l’ordre de plusieurs dizaines ou centaines de ms • structure dépendante de la température • taille des domaines: r < 60 nm • tconf de l’ordre de plusieurs dizaines de ms • structures indépendantes de la température

50. Modèles d’organisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Application à l’étude de l’activation des lymphocytes T Principe: mesures sur cellules Jurkat, dont on maîtrise l’activation par ajout dans le milieu de culture d’un anticorps anti-CD3 humain Complexe TCR/CD3