GİRİŞ

1. AmerikanTiroidBirliği (ATA) KılavuzuKemirgenveHücreModellerindeTiroidHormonEkonomiand EtkisinininAraştırılması

2. GİRİŞ • Son 150 yıl içinde hayvan ve hücre kültürü temelli deneysel modeller, tiroid fizyolojisi ve hastalıklarını anlamamızı sağlayan çok önemli keşifler ortaya çıkarmıştır. • İnsanlar ve küçük kemirgenler arasında tiroid fizyolojisinin çeşitli yönlerden büyük benzerlik göstermesi, deneysel bulguların hızlı bir şeklide klinik alana aktarılmasını kolaylaştırmıştır. • Belirli deneysel teknikler yaygın biçimde kabul görmekle birlikte, standardizasyon eksikliği şüphesiz sonuçlarda heterojenliğe yol açmıştır.

3. GİRİŞ • Belirli deneysel değişkenlerin biyolojik eşik değerlerinin bilinmemesi aynı konuyu inceleyen farklı çalışmaların sonuçlarının uyumsuzluğuna yol açabilir. • Standardizasyon eksikliğini gidermek amacıyla Amerikan Tiroid Birliği (ATA) rodent ve hücre modelli tiroid çalışmaları için strateji ve yaklaşım konsensusu tanımlamak amacıyla temel tiroid araştırmaları alanında uzmanlaşmış kişilerle bir panel düzenlemiştir. Uzmanlar literatürü tarayarak ilk olarak standardizasyondan fayda görecek deneysel uygulamaları tespit etmek ve ikincil olarak ta tiroid çalışması dizayn edilirken önem gerektiren kritik deneysel değişkenleri belirlemekle görevlendirilmiştir. Çalışma grubunun önerileri “Amerikan Tiroid Birliğinin tiroid hormon ekonomi ve rodent ve hücre modellerine etkisini araştırma kılavuzu” olarak yayınlanmıştır.

4. [A] TiROiDBEZiNiNDEĞERLENDiRiLMESi • [A.1] YAPI-FONKSİYON İLİŞKİSİ • ÖNERİ 1 • (a) Tiroid foliküllerinin morfometresi tiroidal aktivite endeksi olarak kullanılabilir. • (b) Otoradyografi; tiroid foliküllerinin toplam aktivitesinin miktarının belirlenmesi ve folikül içinde iyot lokasyonunun tespiti için kullanılabilir. • (c) Tiroid folikülleri içinde iyotun ultrastrüktürel dağılımı ikincil iyon kitle spektrometrisi ile tanımlanabilir. • (d) Tiroid folikülleri, çevre kapiller ağ ve stromadaki protein ekspresyonunu çalışmak için immünohistokimya ile birlikte konfokal mikroskopi iki veya üç boyutlu görüntü rekonstrüksiyonu amacıyla kullanılabilir.

5. [A.2] TİROİD İYOT KİNETİKLERİ • ÖNERİ 2 • Bazolateral hücresel iyot uptake ve iyot apikal akışı (efflux) yarı geçirgen membran üzerinde kültürize edilerek iki-bölmeli sistem oluşturulan tek tabakalı polarize hücreler veya FRTL-5 ile PCCL3 rat tiroid hücre serileri gibi polarize olmayan hücre modellerinde çalışılabilir. Tirositten iyot akışı perklorat uygulanmış tiroid hücre serilerinde incelenebilir. • ÖNERİ 3 • (a) Tiroid bezinin iyot uptake kinetiği radyoaktif iyot uygulaması yoluyla çalışılabilir. Veriler in vivo olarak veya trakea ve tiroidin en blok rezeksiyonunu takiben elde edilebilir. • (b)Tiroid iyot organifikasyon miktarı perklorat atım testi ile ölçülebilir. • (c) Tiroidal sekresyon kinetikleri trakea ve tiroidin en blok rezeksiyonu kullanılarak in vitro olarak çalışılabilir.

6. [A.3] TİROİD GÖRÜNTÜLENMESİ • ÖNERİ 4 • Tiroid bez fonksiyonel görüntülenmesi radyoaktif iyot izotopları kullanılarak gama kamera ile görüntü eldesi veya mikro-PET-CT yoluyla yapılabilir. • Tiroid bezinin morfolojik mikrogörüntülenmesi yüksek frekanslı ultrason ile yapılabilir.

7. [B] DOLAŞIMDAKİ VE DOKUDAKİ TİROİD HORMON DÜZEYLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ • [B.1] SERUM • ÖNERİ 5 • Serum total T4 ve T3 konsantrasyonları standart eğrileri, rodent serumundan elde edilen tiroid hormonu kullanılarak hazırlanmış radyoimmunassay (RIA) veya ELİSA ve İRMA gibi diğer immunoassayler kullanılarak ölçülebilir. • Fibrin oluşumunun pipetlemeyi etkilemesi ve heparin gibi eklentilerin direkt olarak serbest hormon tespitini engelleyebileceğinden ötürü, dolaşımdaki T4 ve T3 ü ölçen tetkikler, plazmadan ziyade en iyi serum kullanılarak yapılır. • Serumdaki serbest iyodotironin endekslerinin (FT4I ve FT3I) tespiti, total serum hormon konsantrasyonu ve serum iyodotironin bağlama kapasitesinin resin veya aktif kömür metotlarından biri kullanılarak ölçümü ile elde edilebilir. • Ardışık izotop dilüsyon kitle spektrometrisi biyolojik örneklerde T4 ve T3 ölçümü için kullanılabilir.

8. ÖNERİ 6 • (a) Rat ve fare serum TSH’u ticari olarak elde edilebilen rat TSH kitleri ile ölçülebilir. Alternatif olarak, türe özgül RIA’ lar, Ulusal Hormon ve Peptid Programı, Ulusal Diabet, Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitisünden (Bethesda, MD) alınan preperatlarla uygulanabilir. • (b) TSH biyolojik aktivitesi standardize in vitro tahlillerle çalışılabileceği gibi in vivo tahlillerle de çalışılabilir. • ÖNERİ 7 • Tirotiropin releasing hormone (TRH) ile indüklenen TSH sekresyonu testi pitüiter bezin TSH salma kapasitesini değerlendirmek için kullanılanbilir. TSH ile indüklenen tiroidal sekresyon testi tiroid bezinin tiroid hormone üretim ve sekresyon kapasitesini değerlendirmek için kullanılabilir.

9. [B.2] DOKU [B.3] DOKU T3 VE TİROİD HORMON RESEPTÖR (TR) SATÜRASYON KAYNAKLARI ÖNERİ 9 (a) Plazma T3’nün doku T3’üne iştirakmiktarıradyoişaretli T3 izleyicilerinintekintravenözenjeksiyonveyapompayardımlıkronikinfüzyonunuiçerendoku-işaretlemeteknikleriyleölçülebilir. (b) Dokudaki TR maksimumbağlamakapasitesi, T3 ilesatürasyonanaliziveScatchardmetodukullanılarakveriredüksiyonuyoluylatahminedilebilir. (c) [131I]-T3 ve [125I]-T4 kullanılarakuygulanan dual-işaretlemeteknikleriplazma T3’ü ilelokalolaraküretilen T3’ün, T4 deiyodinasyonyoluyladoku T3 konsantrasyonunarölatifkatkısınıntespitindekullanılabilir. • ÖNERİ 8 • Doku T3 ve T4 içeriği doku ekstraksiyonu sonrası immunoassaylerle ölçülebilir.

10. [C] HÜCRE İÇİNE TİROİD HORMON TRANSPORTUNUN DEĞERLENDİRİLMESİ • [C.1] İN VİTRO TİROİD HORMON TRANSPORTU • ÖNERİ 10 • (a) Hücre içine iyodotironin transportu, geçici olarak vahşi tip veya mutant tiroid hormone transportörleri eksprese eden hücrelerde çalışılabilir. • (b) Tiroid hormon transportörleri için substrat özgüllük ve kinetik karakteristiklerinin tespiti, çeşitli substratların geniş bir substrat konsantrasyonu aralığında test sonuçlarıyla bağlantı gerektirir. • (c) Karışık hücre kültürleri kullanılması halinde, in vitro disosiye primer hücre kültürlerinde tiroid hormon transportunun değerlendirilmesinin sadece sınırlı bir değeri vardır. • ÖNERİ 11 • Gerçek plazma membran lokalizasyonunun konfirmasyonu tiroid hormon transportörlerini geçici olarak eksprese eden hücreler kullanılarak yapılan çalışmalar için yararlıdır.

11. [C.2] İN VİVO TİROİD HORMON TRANSPORTU • ÖNERİ 12 • (a) İn vivo çalışmalar için, net tiroid hormon transportu tipik olarak bir dizi farklı transportör aktivitelerinin toplamını ifade eder. Belli bir transportörün net transporta katkısının değerlendirilmesi dokuda eksprese olan tüm transportörlerin incelenmesini gerektirir. • (b) Değerlendirilen tiroid hormonlarının metabolizması in vivo transport ölçülürken dikkate alınmalıdır.

12. [D] TİROİD HORMON METABOLİZMSININ DEĞERLENDİRİLMESİ • [D.1] DEİYODİNAZLARIN TESPİTİ, EKSPRESYONU VE MİKTARLARININ BELİRLENMESİ • ÖNERİ 13 • (a) Deiyodinaz aktiviteleri, kinetik profilleri, ve instrinsik özellikleri, (örn: Vmax, Km, yarılanma aktivitesi, kofaktör sensitivitesi) hücre veya doku preperatlarında tespit edilebilir. • (b) Birden çok deiyodinaz içeren hücre veya doku preperatında deiyodinaz aktivite çalışmaları yapılabilir, ancak her deiyodinaz aktivitesinin bağımsız olarak ölçülebilmesi için özel koşullar sağlanmalıdır. • ÖNERİ 14 • (a) Optimum substrat ve kofaktör varlığı koşulu ile herhangi bir deiyodinazın ölçülen Vmax değeri belirli bir zamanda hücre veya dokuda bulunan fonksiyonel enzim miktarının yerine kullanılabilir. • (b) Hücre veya dokuda deiyodinaz genlerin ekspresyonu mRNA düzeylerinin ölçülmesi ile tespit edilebilir.

13. [D.3] PERFÜZE OLAN ORGANLARDA DEİİYODİNASYON [D.2] SAĞLAM HÜCRELERDE DEİYODİNASYON ÖNERİ 16 (a) T4 –T3 dönüşümü ve üriner iyodotiriyonin ekskresyonu perfüze olan rat böbrek veya karaciğer preperatlarında çalışılabilir. (b) Plasental iç-halka deiyodinasyonu guinea domuz perfüzyon sistemi kullanılarak in situ çalışılabilir. • ÖNERİ 15 • Deiyodinasyon yoluyla T4 ve T3 metabolizması, fizyolojik kofaktörle yapılan çalışma olması avantajı ile canlı hücrelerde ölçülebilir.

14. [D.4] TÜM HAYVANLARDA DEİYODİNASYON [D.4] TİROİD HORMON METABOLİZMASININ DEİYODİNASYONSUZ YOLAKLARI ÖNERİ 18 (a) Sulfotransferazaktivitelerivebunlarınintrinsiközelliklerihücreveyadokupreperatlarındasulfatdonorüolarak 3′-fosfoadenozin-5′-fosfosülfat (PAPS) kullanılaraktespitedilebilir. (b) İyodotironinglukuronidasyonaktivitelerimikrozomalhücrevedokupreperatlarında, kofaktörolarak UDP-glukuronikasid (UDPGA) kullanılarak, tespitedilebilir. • ÖNERİ 17 • Toplam vücut deiyodinasyonu canlı hayvanlarda radio-işaretli [125I]-T4 veya [125I]-T3 gibi iyodotiriyonin uygulamasının ardından çalışılabilir. İyodotironinler mini-pompalar yoluyla akut olarak veya uzun-dönemli enjekte edilebilirler. Bu yaklaşım çalışmaların kontrollü fizyolojik kondisyonlar altında yapılmasına olanak sağlar. Farklı iyodin izotopları ile işaretli birden çok iyodotironin uygulanarak ek bilgi elde edilebilir.

15. E. HİPOTİROİDİZM OLUŞTURULMASI VE TİROİD HORMON REPLASMANI • [E.1] HAYVANLARDA HİPOTİROİDİZM • ÖNERİ 19 • Hipotiroidizm oluşturulurken vücut ağırlığındaki artış monitörize edilmelidir. Deneyler arasında çapraz referans için, vücut ağırlık artışında gözlemlenen plato sistemik hipotiroidizm durumunun tanımlanması adına dikkate alınmalıdır. T3-duyarlı gen ekspresyonu ve enzim aktiviteleri, özellikle karaciğer D1 ekspresyonu veya aktivitesi, tiroid statüsünün ilave ölçümü olarak kullanılabilir. • ÖNERİ 20 • (a) Sistemik hipotiroidizm erişkin rat veya farede cerrahi total tiroidektomi ile oluşturulabilir. Sistemik hipotiroidizm genellikle cerrahi sonrası 5-8 haftada gelişir. Hemi-tiroidektomize ratlarda sistemik hipotiroidizmin daha hafif formu gelişir. • (b) Sistemik hipotiroidizm antitiroid ilaçların uygulanması sonucu kimyasal tiroidektomi ile de oluşturulabilir. Hipotiroidizm gelişim süreci değişken olup, kullanılan ilaç rejimine bağlıdır. • (c) Sistemik hipotiroidizm, bezin radyoaktif iyotla ablasyonu ile de oluşturulabilir. Yetişkin hayvanlarda tiroid hormone salınımı 131I uygulamasından 1 hafta sonra belirgin olarak azalır. Yenidoğan hayvanlarda büyüme 131I uygulamasından 3-4 hafta sonra plato yapar. • (d) Sistemik hipotiroidizm durumu kombine yaklaşımlar kullanılarak hızlı ve etkin bir şekilde elde edilebilir.

16. ÖNERİ 21-23 • İkincil hipotiroidizm, ratlara cerrahi hipofizektomi uygulanarak oluşturulabilir. • Öneri 22: (a) Nkx2.1 (T/ebp, TTF-1) KO faresi tiroid disgenezisi için bir modeldir. • (b) Pax8 KO fare, TSH reseptör KO fare ve otozomal-resesif gen hipotiroid (hyt) için homozigot olan fare fetal başlangıçlı ciddi konjenital hipotiroidizm sergiler. • (c) Dual oksidaz 2 (DUOX2) geninde missense mutasyonu olan fare ve Cog fare (konjenital guatr) konjenital hipotiroidizmin daha hafif modelleridir. • (d) TRH KO fare tersiyer hipotiroidizm modeli olup, tiroid fonksiyonu sadece hafif olarak bozulmuştur. • Öneri 23: (a) Deiyodinaz aktiviteleri ile ilişkili hücre/doku hipotirodizminin özgül formları in vivo olarak D2 yolağının bozulması yolu ile veya D3 yolağının indüksiyonu ile çalışılabilir. • (b) İyodotironin transportu ilişkili hücre/doku özgül hipotiroidizm in vivo olarak çeşitli transport sistemlerinin bozulması yoluyla çalışılabilir.

17. [E.2] HAYVANLARDA TİROİD HORMON REPLASMANI • ÖNERİ 24 • (a) Önceden hipotiroid hale getirilmiş yetişkin ratlarda günlük T4 replasman dozu, büyüme hızı ötiroid durumun tanımlanasında birincil gösterge olarak kabul edilecekse, yaklaşık günlük üretim miktarına benzer olmalıdır. Daha yüksek L-T4 dozları serum TSH’nun normalize olması gerekliliği halinde kullanılmalıdır. Diğer tiroid hormon sensitif göstergeler dikkate alınacaksa, uygun T4 dozu her vakaya özel amprik olarak tespti edilmelidir. • (b) Kemirgenlerde tiroid hormon uygulaması için parenteral yol (örn: intra-peritoneal, subkutan) osmotik pompalar veya subkutan yerleştirilen pompalar aracılığıyla tercih edilir. • (c) Hipotiroid neonatal fareler için T4 replasmanı yaşa uygun rejimler ile yapılmalıdır. • (d) Fare embriyonik kök-hücreleri fonksiyonel tiroidal foliküler hücreye in vitro olarak dönüşmek, hipotiroid fareye transplante edildiğinde sistemik ötiroidizmi sağlamak için kullanılabilir.

18. [E.3] HÜCRE KÜLTÜRÜNDE HİPOTİROİDZM • ÖNERİ 25 • (a) Kültürdeki hücreler, ortama aktif-kömürlü serum, resinli serum, hipotiroid hayvandan alınan serum eklenerek veya hiç serum eklenmeyerek, hipotiroid yapılabilir. • (b) Kültürdeki hücreler bir TR antagonisti kullanılarak hipotiroid yapılabilir.

19. [F] TİROİD HORMON SİNYALİNİN ARTTIRILMASI • [F.1] HAYVANLARDA TİROTOKSİKOZ • ÖNERİ 26 • (a) Akut sistemik tirotoksikoz parenteral (i.p veya i.v) yolla 1.0 ug T3/g vücut ağırlığı (T3’ün TR-satürasyon dozu) uygulanarak oluşturulabilir. Genomik etkiler 60 dakika içinde görülebilir ve fizyolojik etkiler yaklaşık 6 saat içinde başlar. • (b) Uzun dönemli sistemik tirotoksikoz, günler, haftalar ve aylarca süren kronik T3 veya T4 tedavisi ile oluşturulabilir. Uygulama yolu parenteral veya su–yemeğe katılmak şeklinde olabilir. Kronik çalışmalar için kaşeksi ve ölüme yol açabilen TR-satüre edici dozlardan kaçınılmalıdır. Çalışmalar arası karşılaştırmalara olanak sağlanması için T3 dozları günlük T3 veya T4 replasman dozlarının katı olarak verilmelidir. • ÖNERİ 27 • D2 yolağının in vivo aktivasyonu veya D3 yolağının inaktivasyonu tiroid hormon sinyalinde hücre/doku özgül artışların çalışılmasında kullanılabilir.

20. [F.2] HÜCRE KÜLTÜRÜNDE TİROTOKSİKOZ • ÖNERİ 28 • (a) Akut tirotoksikoz hücre kültüründe ortama T3 eklenmesi yoluyla elde edilebilir. T3’ün serbest fraksiyonu ile total T3 konsantrasyonunun çarpımı serbest hormon konsantrasyonunun tahminini sağlar. Serbest fraksiyonlar direk olarak tespit edilemiyorsa, serbest hormon konsantrasyon tahminleri için serbest fraksiyon değerleri ile ilgili basılmış yayınlar temel alınır. • (b) Hücre kültüründe tirotoksikoz oluşturulurken deiyodinazların muhtemel varlığı çalışılan her hücre tipi için dikkate alınmalıdır.

21. [F.3] TİROİD HORMON ANALOGLARININ KULLANIMI • ÖNERİ 29 • Tiroid hormon sinyali in vivo veya in vitro olarak tiroid hormon analogları ile tetiklenebilir. Bunların bir kısmı doku-selektivitesi veya TR isoform selektivitesine sahiptir. Bir dizi yüksek selektif TR β analoğu, baskın olarak TR β’ya sahip (örn: karaciğer veya pitüiter bez gibi) dokuyu hedefler. Farklı analogların ve T3’ün ekümolar doz/konsantrasyonlarının kullanımı karşılaştırma çalışmalarında başlangıç noktası olarak önerilir.

22. [G] İYOT EKSİKLİĞİ VE TİROİD HORMONUNUN MATERNAL-FETAL TRANSFERİ • [G.1] KEMİRGENLERDE İYOT EKSİKLİĞİ • ÖNERİ 30 • (a) İyot eksikliği durumu, kemirgenleri düşük iyotlu diyetle (< 0.02 ug iyote/g) besleyerek oluşturulabilir. Iyot eksikliğinin daha hafif dereceleri diyet değiştirilerek elde edilebilir. Tiroid ekonomisine etki 10 gün gibi kısa süre içinde görülebilirken, çoğu parametre için net etki en az 1 aylık düşük iyotlu diyete gereksinim gösterir. • (b) Hayvanlarda iyot eksikliği, idrar iyot atılımının (düşük iyotlu diyet alan hayvanlarda 5-10 kat düşük olmalıdır) belgelenmesi ile monitörize edilebilir. • (c) Tiroid içi iyot eksikliği içme suyuna %1’lik KClO4 tatbikini takiben NIS inhibisyonu yoluyla oluşturulabilir. Bu yaklaşımla tiroid iyot depoları 1 hafta içinde tükenir. Daha uzun tedavilerin sistemik hipotiroidizme neden olacağı hesaba katılmalıdır.

23. ÖNERİ 31 • (a) Tiroid bezinin kendisi üzerine iyot eksikliğinin etkisi, bez boyutunun ölçülmesi (en az 2 kat artış görülmeli) ile ve histolojik olarak düşük iyotlu diyetin neden olduğu farklı derecelerde hiperplazi ve hipertrofi ile değerlendirilebilir. Foliküllerdeki kolloid miktarı azalır ve daralmış foliküler boşlukları çevreleyen epitelyal hücreler normal küboidal hücreler yerine kolumnar hücrelerden oluşur. • (b) Tiroid ekonomisine iyot eksikliğinin etkisi serum T4 ve tiroglobulindeki T3/T4 oranı ölçülerek monitörize edilebilir. TSH artışı erken bulgu değildir. Benzer şekilde serum T3 düzeyi iyot eksikliği ciddi boyuta ulaşıncaya kadar korunur. • ÖNERİ 32: Gestasyonel veya neonatal iyot eksikliği düşük iyotlu diyetle beslenme ile oluşturulabilir. Kemirgenlerdeki kısa gestasyon süresi, annelerin düşük iyotlü diyete önceden tabi tutularak gebelik öncesi hipotiroksineminin sağlanmasını gerektirir.

24. [G.2] PLASENTAL TİROİD HORMON TRANSFERİ • ÖNERİ 33 • Anneden fetüse tiroid hormonlarının plasental transferi MMI-ile tedavi edilmiş ve tiroid hormonu replase edilmiş gebe dişilerde fetal dokuda T3 ve T4 düzey ölçümü ile çalışılabilir.

25. [H] TİROİD DIŞI HASTALIK MODELLERİ • ÖNERİ 34 • Tiroid dışı hastalık modeli olarak açlık, tiroid hormonu üretim, metabolizma ve aksiyonuna etkinin çalışılması için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. • ÖNERİ 35 • (a) Kemirgenlerde geniş cerrahi, yanık, inflamatuar ağrı, bakteriyel enfeksiyon veya uzamış immobilizasyon gibi major vücut travması veya ciddi hastalık tiroid dışı hastalık hayvan modelleri olarak kullanılabilir. • (b) Bakteriyel lipopolisakkarid uygulanması santral hipotiroidzm yaratmak için kullanılabilir. Hipotalamik TRH azalarak serum tiroid hormon düzeylerinde düşmeye yol açar.

26. [I] DOKU VE HÜCRESEL DÜZEYDE TİROİD HORMON SİNYALİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ • [I.1] TİROİD HORMON STATÜ BELİRTECİ OLARAK GEN EKSPRESYONU • ÖNERİ 36 • T3’e doku cevap statüsünün genel değerlendirmesi için bilinen cevap genlerinin temsilcilerinin analizi aydınlatıcı veri sağlar. • [I.2] mRNA EKSPRESYON DÜZEYLERİNİN PCR ANALİZİ • ÖNERİ 37 • T3-duyarlı gen ekspresyonu çalışmak için seçilecek güncel metod RT-qPCR olup uygun valide edilmesi halinde kesin mRNA düzey ölçümü sağlar. Çalışılan sistem içinde internal kontrol genlerinin (örn. referans genler) T3 duyarlı olmamaları konusunda gereken önlemlerin alındığından emin olunmalıdır.

27. [I.3] TİROİD HORMON-DUYARLI mRNA’NIN GENOM-WIDE ANALİZİ • ÖNERİ 38 • (a) mRNA ekspresyon paternleri için tüm genom taramanın microarray ve diğer yöntemleri tiroid hormon sinyal yolak manipülasyonlarına cevaben oluşan gen ekspresyon değişikliklerinin geniş skala analizinde kullanılabilir. Aday transkriptler RT-qPCR, Western blot veya in situ hibridizasyon analizi gibi bağımsız yöntemler ile değerlendirilmelidir. • (b) RNAseq derin-sekanslama teknolojisi kullanır ve mikroarray ile karşılaştırıldığında daha kesin mRNA ve varyant mRNA isoform düzey ölçümü sağlayabilir.

28. [I.4] TİROİD HORMONU İLE GEN REGÜLASYON MEKANİZMASI • ÖNERİ 39 • TR’ninhedef gen regülasyonu, röportör gen plasmidineilave TR-ekpreseeden plasmid ileko-transfekteolmuşdokukültürhücrelerindearaştırılabilir. Fizyolojikaralığınüzerindefarklıdozlardaeklenen T3’e cevabenröportörüntransaktivasyonudeğerlendirilirvecevaplarkonakhücreözgülfaktörlerceetkilenebileceğinden, farklıhücredizilerinde test edilebilir. • ÖNERİ 40: (a) Elektroforetikmobilitekaymatesti (EMSA) TR ile DNA parçasınındirekbağlanmasınıgösterebilir, böylecebirgeninTR’nindirekhedefiolduğukanıtısağlanır. EMSA, elektroforezetabitutulduğunda protein bağlıDNA’nın, bağlıolmayanDNA’dandahayavaşhızdagöçettiğigözleminedayanır. DNA unsuru (prob) protein:DNAprobkomplekslerinintespitindesensitifolmakiçingenellikleradyoişaretlidir. • (b) Kromatinimmünopresipitasyon (ChIP) TR’ninhedef gen iledokuveyahücreserigenomundadoğalkontekstebağlandığınıgöstermektekullanılabilir. ChIP’in en kritikihtiyacıimmünopresipitasyoniçinyüksekkalitedeözgülantikorvarlığıolup, buözgüllükkontroldeneylerinceortayakonur. • (c) ChIP’indahaileriuygulamalarıçokkompleksteknikgerektirir. Bunlar, nükleerfaktörüntümgenomdabağlanmabölgelerinitespitetmektekullanılanChIPilemicroaaraykombinasyonu (ChIP-chip) veyenijenerasyonsekanslama (ChIPseq) analizleridir.

29. [I.5] DOKUDA TİROİD HORMON VE TR SİNYALİNİ GÖSTEREN FARE MODELLERİ • ÖNERİ 41 • (a) Endojen Thra ve Thrb genlerine hedefli KO ve knockin mutasyonu olan fare aileleri in vivo olarak TR fonksiyonunun çalışılması için model sağlarlar. • (b) Bilinen T3 reseptörlerinden (TRα1, TRβ1 ve TRβ2) yoksun olan fareler TR aracılıklı sinyallerin tam yokluğu için modeli olarak kullanılabilirler. • (c) Hem Thrb ve hem de Thra genlerine uygulanan kodlama sekans değişiklikleri tiroid hormon rezistansı görülen insan sendromları için fare modeli sağlarlar. • (d) T3-duyarlı kimerik protein ekprese eden transgenik röportör fareler çeşitli dokularda T3 varlığını monitörize etmeye olanak veren in vivo model sağlarlar. • (e) Endojen Thra ve Thrb genlerine hedefli insersiyonlar protein taglerle birleşmiş TR proteinleri yaratır, bunlar in vivo olarak özgül hücre popülasyonlarında TR isoform ekspresyonlarını monitörize etmekte kullanılabilir.

30. [J] SİSTEMİK BİYOLOJİK PARAMETRELER YOLUYLA TİROİD HORMON SİNYALLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ • ÖNERİ 42 • Kemirgen modelleri tiroid hormonun beyin gelişim ve fonksiyonunu nasıl etkilediğini çalışmak için kullanılabilir. Fetal tiroid fonksiyonunun başlangıç zamanı ile kronolojik yaş arasındaki korelasyon kemirgenlerde insanlardan farklıdır. Hayvanın kronolojik yaşından çok nörobiyolojik gelişim evresi dikkati alınmalıdır. • ÖNERİ 43 • Santral sinir sisteminin fonksiyonel çeşitlilik ve yapısal karmaşıklığı bilindiğinden, beyinde T3 duyarlı genlerin çalışılması in situ hibridizasyon veya immunohistokimya yoluyla büyük oranda artmıştır. • ÖNERİ 44 • (a) Tiroid hormon eksikliğine bağlı fonksiyonel duyma bozuklukları, uyaran yoğunluk eşiklerinin tespiti için auditor evoked beyinkökü cevapları ölçülmek yoluyla çalışılabilir. • (b) Tiroid hormon eksikliğine bağlı vizüel fonksiyon bozuklukları dalgaboyu sensitivitesi ve ışık yoğunluk eşiklerinin tespiti için elektroretinogramda vizüel evoked cevapların ölçülmesi ile çalışılabilir.

31. ÖNERİ 45-48 • Nöron iyon kanalları ve sinir iletimine tiroid hormon etkisi yama klemp analizi veya mikroelektrot kaydı ile incelenebilir. • ÖNERİ 46: (a)Standardize nörolojik testler tiroid hormonunun nöromusküler kontrolü hem motor hem de serebeller düzeylerde nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir. Tamamlayıcı metodların kullanılması önerilir. • (b) Duygudurum, davranış, öğrenme ve hafıza tiroid hormonuna duyarlıdır ve oluşturulmuş davranışsal testler kullanılarak incelenebilir. Tamamlayıcı metodların kullanılması önerilir. • ÖNERİ 47: Tiroid hormonun davranışsal ve metabolik parametrelere hipotalamik etkileri direk olarak T3’ün intra-serebro-ventriküler (ICV) uygulanması ile çalışılabilir • ÖNERİ 48: (a) İn vitro olarak tiroid hormonuna cevap veren beyin hücre modelleri santral sinir sisteminde T3 etkilerinin incelendiği model olarak kullanılabilir. • (b) İn vitro olarak tiroid hormonuna cevap veren pitüiter hücre modelleri anterior pitüiter bezde T3 etkilerinin incelendiği model olarak kullanılabilir.

32. [J.2] KALP VE KARDİYOVASKÜLER SİSTEM • ÖNERİ 49 • Kardiyakfonksiyonvemorfolojiüzerinetiroidhormonetkileriultrasonveyamanyetikrözonansgörüntülemeile non-invazivolarakdeğerlendirilebilir. • ÖNERİ 50 • (a) Kalphızıvekanbasıncıüzerinetiroid hormone etkisininanaliziserbestdolaşanhayvanlardalongitüdinalanalizgerektirir. • (b) Tiroidhormonun sol ventrikülkontraktilfonksiyonunaetkisi in vivo olarak sol ventrikülbasınçlarınınkaydedilmesiiledeğerlendirilebilir. • ÖNERİ 51 • (a) Kardiyakkontraktilfonksiyonüzerinetiroidhormonetkilerininanaliziizoleintaktkalpveyadokupreperatlarıkullanan ex-vivo deneylereihtiyaçduyar. • (b) Tiroidhormonunkardiyak Ca2+ homestazınaetkisitrabekülveyapapillerkaslardadeğerlendirilebileceğigibiizoletekkardiyomiyozitlerde de değerlendirilebilir.

33. ÖNERİ 52-54 • (a) Tiroid hormonuna kardiyak doku yanıtı histolojik metotlar ve tiroid hormon duyarlı gen ekspresyon çalışmaları yoluyla değerlendirilebilir. • (b) Kontrakte olan miyokard T3 duyarlı röportör genleri kodlayan plasmid DNAyı alıp kardiyomiyozit özgül T3 bağımlı transkripsiyon aktivitesinin in vivo olarak tespitine izin verir. • ÖNERİ 53: Rat ve fare kardiyomiyozitlerinin primer kültürleri ile birlikte H9C2 hücre serisi, tiroid hormon etkisinin çalışılmasında kullanılabilir. • ÖNERİ 54: Vasküler fonksiyon üzerine tiroid hormon etkisi arteriyel halkalar ve vasküler düz kas hücre kültürlerinde değerlendirilebilir.

34. [J.3] İNTERMEDİYER METABOLİZMA VE ENERJİ HOMEOSTAZI • ÖNERİ 55 • (a) Ratlarda sistemik tirotoksikoz ve hipotiroidizm modelleri oluşturulabilir. Dikkate alınacak deneysel sonuçlar oksijen tüketimini (VO2), solunum oranını (RQ), beslenme davranışını, yemek ve su alımını ve hareket/aktiviteyi kapsar • (b) Belirli bir doku üzerine sistemik hipotiroidizm veya tirotoksikozun etkisi uygun olarak tedavi almış hayvandan izole edilen doku veya hücrede çalışılabilir. • (c) Belirli bir hücrede hücresel enerji tüketimi ve metabolik yolaklara tiroid hormonun direk etkisinin izole edilmesi için tiroid hormon tedavisi uygulanmış hücre kültürleriyle in vitro çalışmalar yapmak gerekir. • (d) İzole mitokondri kullanan çalışmalar mitokondriyal biyolojiye T3 etkisinin araştırılması için kullanılabilir. • ÖNERİ 56 • (a) Soğuk uygulamaya (4-5°C) akut veya kronik duyarlılık tiroid hormonun termojenik etkilerinin çalışılması için kullanılabilir. • (b) Kahverengi adipöz doku termogenezi tiroid hormon ile pozitif regüle olur ve rat veya fareye adrenerjik agonist infüzyonu esnasında interskapüler BAT (iBAT) yastıkçığında çalışılabilir.

35. ÖNERİ 57 • (a) Tiroid hormonun metabolik etkilerinin çalışılması için termonötral kondisyonlar (örn kor ısının zorunlu termogenezis ile sağlandığı ortam ısısı) sağlanmalıdır. • (b) Tiroid hormonun termojenik etkisinin çalışılması için diyetle oluşturulan obezite modelinde, büyüme hormon salınımı ve lineer büyüme, iştah, sempatik aktivite ve çevresel sıcaklık gibi ek tiroid hormon bağımlı değişkenler mutlaka hesaba katılmaldır. • ÖNERİ 58 • Adipoz dokuda tiroid hormon bağımlı metabolik olaylar, taze izole beyaz veya kahverengi adipozitlerden veya in vitro olarak diferensiye edilmiş beyaz veya kahverengi adipozitlerden hazırlanmış doku preperatlarında araştırılabilir.

36. ÖNERİ 59 • (a)Karaciğerde lipogenez ve yağ aside oksidasyonunun simultane indüksiyonu tiroid hormonun önemli etkileridir. Anahtar hız sınırlayıcı enzimlerin ekspresyonunun çalışılması kadar bu işlemlerin hayvan ve hücre modellerinde hızlarının tahmin edilmesi karaciğerde tiroid hormon sinyal ebadının ölçümünde kullanılabilir. • (b) Serum kolesterol düzeyleri ve karaciğer kolesterol içeriği karaciğere tiroid hormonun metabolik etkilerinin biyolojik belirteçleri olarak kullanılabilir.

37. [J.4] İSKELET KASI • ÖNERİ 60-65 • Tiroid hormonunun kas enerji metabolizması ve kontraktil özellikleri üzerine etkileri perfüze edilen arkabacak preperatlarında analiz edilebilir. • Kas özelliklerini düzenleyen nöromusküler aktivite ile tiroid hormon interaksiyonu kasların in vivo olarak elektriksel stimülasyonu ile çalışılabilir. • Kontraktil özellikler üzerine tiroid hormon etkisi sağlam kas ve izole kas liflerinin ex vivo analizi ile değerlendirilebilir. • Tiroid hormonuna iskelet kası doku yanıtı gen ekspresyon ve enzim tahlillerinin analizi ile değerlendirilebilir. • İskelet kasının lif tipi kompoziasyonuna tiroid hormon etkisinin değerlendirilmesi için doku kesitlerinin histokimyasal analizi gerekir. • İskelet kas hücrelerinin primer kültürleri ve çeşitli hücre serileri tiroid hormone ile regüle olan gen ekspresyonu ve bunun kontraktil aktivite ile ilişkisinin çalışılmasında kullanılabilir.

38. [J.5] İSKELET • ÖNERİ 66-69 • Postnatal lineer büyüme ve kemik matürasyonuna tiroid hormon etkileri en iyi, ex vivo olarak, tanımlanan yaştaki hayvanların harmanlanmış örnekleri kullanılarak tespit edilir. • Tiroid statüsündeki değişiklikler veya tiroid hormon etkinliğindeki bozulmaya erişkin kemiğin yapısal ve mineralizasyon cevabı farklı rezolüsyon düzeylerinde ilave görüntüleme teknikleri kullanılarak değerlendirilebilir. • Kemik yapı ve mineralizasyonunda tiroid hormonca indüklenen değişiklikler, yüklenme halinde biyomekanik özelliklerin tespiti yoluyla araştırılabilen, fonksiyonel anormallikler olarak yansıtılır. • Değişken tiroid statüsüne cevaben kemik rezorpsiyon ve formasyonundaki metabolik cevap ve değişiklikler indirekt olarak serum parametrelerinin ölçümü ile değerlendirilebilir. • Kemik döngüsü üzerine tiroid hormon etkisi, osteoklastik kemik rezorpsiyonu, osteoblastik kemik formasyonu veya her ikisinin komibansyonunu kapsayabilir. Tiroid hormonuna cevaben kemik döngü belirteçlerinin biyokimyasal analizi bu belirteçlerin indirek kaba bir değerlendirmesini sağlarken, bunlar direk olarak kemik dokuda da araştırılmalıdır.

39. ÖNERİ 70 • (a) Kıkırdağa tiroid hormon etki mekanizmaları neonatal farelerin kol veya kaburga kafesinden hazırlanan kondrosit kültürlerinde çalışılabilir. • (b) Osteoblast kültürleri hücre diferensiyasyonuna tiroid hormon etkisinin araştırılması için kullanılabildiği gibi, in vitro olarak fonksiyonel kemik mineralizasyon tetkiki olarak ta kullanılabilir. Böyle kültürler standart teknikler kullanılarak neonatal fareden kalvarianın kollajenaz ile sindirilmesi sonucu elde edilir. • (c) Tiroid hormonunun osteoklastogenezis ve fonksiyon üzerine etkileri 6 haftalık farenin uzun kemiklerinden hazırlanan osteoklast kültürlerinde incelenebilir. Kullanılan protokoller; in vitro osteoklast formasyonunun indüklenmesi için ekstrakte edilen kemik iliğinin monosit koloni stimulan faktör ve nükleer faktör kappa B-ligandının reseptör aktivatörü ile muamele edilmesini içerir.