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血清脂类测定

血清脂类测定. 浙江中医药大学 生命科学学院 生物化学教研室. 【 实验目的 】 学习血清甘油三酯的测定原理。 掌握甘油三酯的测定方法和操作技术。. 【 实验原理 】

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血清脂类测定

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Presentation Transcript

  1. 血清脂类测定 浙江中医药大学 生命科学学院 生物化学教研室

  2. 【实验目的】 学习血清甘油三酯的测定原理。 掌握甘油三酯的测定方法和操作技术。

  3. 【实验原理】 血清中甘油三酯经脂蛋白脂酶(LPL)作用，可以水解为甘油和游离脂肪酸(FFA)，甘油在ATP和甘油激酶(GK)的作用下，生成3-磷酸甘油，再经磷酸甘油氧化酶(GP0)作用氧化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢(H202)， H202与4-氨基安替比林(4-AAP)及4-氯酚在过氧化物酶(POD)作用下，生成红色醌类化合物，其显色程度与TG的浓度成正比。

  4. 【实验原理】 脂蛋白脂酶（LPL） ①甘油三酯 甘油+游离脂肪酸 甘油激酶 ②甘油+ATP 3一磷酸甘油 磷酸甘油氧化酶 ③3-磷酸甘油 磷酸二羟丙酮+过氧化氢 过氧化物酶 ④H202+4-氨基安替比林+4-氯酚 红色醌 （苯醌亚胺非那腙）

  5. 【试剂与器材】 • 1. 甘油三酯测定试剂盒 • 2.血清 • 3.酶标仪，酶标板，板条，微量进样器 • 4.生化培养箱

  6. 【操作步骤】 1.配制工作试剂： 取R1：R2=9：1 （2.7：0.3） 的比例配制工作试剂,置于玻璃试管或小烧杯中（比需要的总量多配一点,可以几组合作一起配制,减少浪费）。

  7. 【操作步骤】 2.取酶标板1块，板条1条，按下表操作： 空白管 标准管 测定管 测定管 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 血清 一 一 — 6μl 6μl 6μl 6μl 标准液 一 6μl 6μl ———— 生理盐水 6μl 一 一 ———— 工作试剂 300μl 300μl 300μl 300μl 300μl 300μl 300μl 3.置于37℃生化培养箱10min，492nm波长处在酶标仪上读取各管的吸光度A。

  8. 结果与计算 血清甘油三酯= 测定管吸光度平均值 × 标准物浓度 标准管吸光度平均值 （mmol/L） （mmol/L ） 甘油三酯标准物浓度为2.26m mol/L

  9. 【结果与计算】 甘油三酯： TG正常范围：0.55-1.70mmol／L 边缘增高：1.7-2.25mmol／L 增高：2.26-5.64mmol／L 很高：大于、等于5.65mmol／L。

  10. 【临床意义】 血清TG增高常见于家族性脂类代谢紊乱、肾病综合征、糖尿病、甲状腺功能减退、急性胰腺炎、糖原积累病、胆道梗阻、原发性甘油三酯增高症、动脉粥样硬化等。 血清TG降低比较少见，慢性阻塞性肺疾患、脑梗死、甲状腺功能亢进、营养不良和消化吸收不良综合征等可引起血清TG的降低。

  11. 【注意事项】 1.本方法没有进行抽提和吸附，所以血清中游离的甘油对TG测定结果有一定的影响。 2.方法中所用酶试剂在4℃避光保存，至少可稳定3天至1周，出现红色时不可再用，试剂空白的吸光度应＜0.050。

  12. 3.取血注意事项： 要求空腹12h后再进行采血，并要求72h内不饮酒，否则会使检测结果偏高。无论是使用血浆还是使用血清作为检测标本，取血后都应及时分离，以免红细胞膜磷脂在磷脂酶的作用下产生游离甘油(FG)，或者抗凝剂存在时红细胞内水溢出而稀释血浆降低TG值。分离血浆前，标本最好放于冰水中，并尽快分离血浆，避免TG自发水解出现误差。 4.本实验方法的线性上限为11.3mmol/L，若所测TG值超过了11.0mmol/L，则可用生理盐水稀释后再测。

  13. 【评价】 本实验介绍的是一步终点法，具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点，适用于手工和自动化测定；其主要缺点是所测TG值包括了血清中游离的甘油。为了除去游离的甘油(FG)的干扰，常用的方法有两种： 1.外空白法 即同时使用不含LPL的酶试剂测定FG作空白值，此法需作双份测定，使成本加倍，但是可同时得到血清中FG数据；

  14. 2.内空白法 又称为两步法或双试剂法，将酶试剂分作两部分，其中LPL和4—AAP组成试剂II，其余部分为试剂I，血清先加试剂I，37℃孵育后，因无LPL存在，TG不被水解，FG在GK和GPO的作用下反应生成H2O2，但因不含4-AAP，不能完成显色反应， H2O2可在过氧化物酶作用下被分解掉，故可除去FG的干扰；再加入试剂II，即可测出TG水解生成的甘油。内空白法虽然增加了操作步骤，但不增加试剂成本，且排除FG干扰效果好，预孵育5min即可排除4mmol／L FG的干扰。本法线性范围在11.4mmol／L以内，精密度为：批内CV≤3％、批间CV≤5％。加入不同浓度TG，平均回收率98．6％，加入甘油的平均回收率103．6％。与乙酰丙酮法比较：y＝0.996x—4.2，r＝0.9996。 因为LPL除水解TG外，亦能水解甘油一酯和甘油二酯(血清中这二者的浓度约占TG的3％)，所以本法测定结果包含了后二者的值。

  15. 【注意事项】 1在实验操作过程中，配制工作试剂时要格外小心，看清标注以免搞错 2.使用微刃进样器前，应先润洗，以免影响实验结果 3.每次加样完成后，迅速将其混匀，使其充分反应 4.测定血清甘油三酯，由于酶进行提取和吸附，血清中难免会由游离甘油（FG），对实验测定结果会有一定的影响

  16. 【思考题】 1、简述酶法测定甘油三酯的基本原理。 2、检测血清甘油三酯时如何除去游离甘油的干扰?

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