Háttér és vizsgálataink célja

1. Citogenetikai markervizsgálatok gyermekkori aplasticus anaemiában Farkas Gyöngyi, Székely Gábor, Vass Nagyezsda, Kiss Krisztina, Gundy Sarolta Országos Onkológiai Intézet, Budapest Háttér és vizsgálataink célja Az aplasticus anaemia (AA) a csontvelő vérsejtképzési elégtelensége, amely nagyfokú vérszegénységben nyilvánul meg, és amelynek recesszíven öröklődő és malignitásra különösen hajlamosító formája a nagyrészt gyermekkorban kialakuló Fanconi anaemia (FA). A szerzett és öröklött variációk gyógyítása (mind FA-ban, mind AA-ban) csontvelő transzplantációval biztosítható. A FA-s betegek kondicionáló kezelése során a csontvelő kiölése azonban nagy körültekintést igényel, hiszen a veleszületett repair-deficiencia miatt a Fanconi anaemiában kevesebb mennyiségű az ATG (anti-thymocytaglobulin) és cyclophosphamid kezelésben kell részesíteni a betegeket, hiszen a nagyobb dózisú kondicionáló kezelés egy bizonytalan diagnózis miatt a beteg halálához vezethet. Differenciáló diagnózishoz in vitro mitomycin-C expozíciót alkalmazunk, aminek hatására a limfociták DNS-ében a keresztkötések rendkívül sok kromatidtörés kialakulásával párosulnak. FA-ban a tíznél több kromatid törés/sejt (b/c) gyakoriság a sejtek >80%-ára, mozaicizmusban kb. 40 %-ára jellemző (Joenje and Patel,2001. Nat. Rev.Genet. 2:446-457) . Amennyiben a sejtek kisebb arányában fordulnak elő törések, nagy valószínűséggel aplasticus anaemiával állunk szemben. A differenciál diagnózis felállítása mellett azt kívántuk megállapítani, hogy az AA-s betegek postreplikációs (G2 fázisú) reparációja zavart szenved-e és ez korrelál-e a spontán kromoszóma törékenységgel. A G2 repair-deficiencia vizsgálatához in vitro körülmények között bleomycin kezelést alkalmaztunk. Anyag és módszer Csontvelő transzplantációra előjegyzett 14 FA gyanús esetben (Szt. László Kórház és OGYK betegei) és 8 kontroll személynél a perifériás vér limfociták spontán kromoszómatörékenysége mellett MMC-vel és bleomycinnel indukált kromoszóma törékenységet analizáltunk. MMC-vel két teljes sejtcikluson keresztül 72 óráig, bleomycinnel a sejtek 2. osztódásának csak az utolsó 5 órájában kezeltük a sejteket, in vitro. A gyermek betegek életkora 1-9 év, a felnőtteké 21-51 volt. A limfociták tenyésztése a szokásos módszerekkel történt amit sejtfeltárás, majd konvencionális festés követett (ICPEMC,1988). Valamennyi módszerrel személyenként 100 sejtet értékeltünk. Spontán fragilitási vizsgálatainkban számbeli és szerkezeti aberrációkat különítettünk el. A bleomycin (BLM)-teszthez a második osztódási ciklus lejárta előtt 5 órával 30 µg/ml végkoncentrációban BLM-nel in vitro kezeltük a sejtkultúrákat, amit colcemides blokkolás és a szokásos sejtfeltárás, illetve festés követett. Az egyes személyek mutagénnel szembeni érzékenységét az egy sejtre jutó kromatidtörések átlagával (b/c) jellemeztük. (Szekely et al., 2003, Mutagenesis). Az MMC -tesztnél a sejtkultúrákhoz 50 ng/ml (300 nM) koncentrációban adtunk Mitomycin-C-t, majd a 72 órás tenyésztés következett. Az indukált kromatid törések meghatározása a következők szerint történt: Gap: Bleomycin tesztnél nem számoljuk, törés 1, exchange 2 törésnek felel meg, az MMC tesztnél a keletkező tri-és quadriradiálisokat két törésnek számítjuk. Az értékelésnél szintén az egy sejtre jutó kromatidtöréseket határoztuk meg, ill. meghatároztuk a normál ill. a 10-nél több törést mutató sejtek arányát. A statisztikai elemzéshez Wilcoxon- és 2-tesztet használtunk. Fanconi- és aplasticus anaemia differenciál diagnózisa 1. Táblázat .Spontán kromoszómaaberrációk egyéni értékei betegekben és kontrollokban Eredmények AA-ban mind az aberráns sejtek (p=0,0393), mind az összes kromoszómaaberrációk száma (p=0,0393) szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll személyekben. Az aberrációk nagy részét a kromatidtörések képviselték (1.Táblázat) . AA-ban a spontán kromatidtörések négyszer gyakrabban fordultak elő, mint a nem beteg kontrollokban (0,016±0,003 vs.0,003±0,002) (3.Táblázat). Az MMC indukálta b/c hányados szignifikánsan nem különbözött az egészségesek értékeitől (1,03 ±0,60 vs. 0,75±0,32) (3.Táblázat) és több mint 10 b/c csak a sejtek 1-4%-ban volt található 4 betegnél, de ez az arány egy betegnél sem érte el a Fanconi anaemiára jellemző 80%-ot, vagy a mozaicizmusra jellemző 40%-ot. Tehát nagy valószínűséggel valamennyi esetben a szerzett aplasticus anaemia került diagnosztizálásra, amit egyértelműen a spontán kromatid törékenységben megnyilvánuló genetikai instabilitás jellemez. Annak megállapítására, hogy vajon a posztreplikációs repair-kapacitás csökkenése jellemző-e erre az AA-s betegcsoportra megállapítottuk, hogy bár az a betegek és a kontrollok között csoportszinten nincs (1,41 ±0,16 b/c vs. 1,44 ±0,40 b/c), de individuálisan meglehetősen nagy eltérések mutathatók ki (0,4-2,5 b/c AA vs 0,52-1,88 b/c Kontroll) (2.Táblázat). 2.Táblázat. In vitro indukált kromatid törések MMC és bleomycinkezelés után Egyéni értékek (beteg vs. Kontroll) 3.Táblázat.Spontán fragilitási és indukált kromatid törés/sejt (b/c) értékek. AA-s betegek és kontroll személyek csoportértékei Konklúziók 1.Empirikusan várható volt, hogy a FA diagnózisát elvethetjük, hiszen genetikailag egy nagyon ritka betegségről van szó (1/ 200 000-400 000; (Joenje and Patel, 2001. Nat Rev.Genet. 2:446-457) Az FA-AA differenciál diagnózisában a spontán kromoszómaaberráció- és az MMC teszt használata viszont indokolt. 2.AA-as betegek esetében az MMC- és a Bleomycin teszt eredményei - bár még kis esetszámmal rendelkezünk - úgy tűnik nincsenek összefüggésben egymással, vagyis a teljes sejtciklus esetleges repair-zavara nem hozható összefüggésbe a G2/M fázis kromoszóma-szintű repair deficienciájával. 3. Az AA-ban kimutatott nagy individuális eltérések mellett indokoltnak látszik a kromatid-típusú aberrációk matematikai eloszlásának vizsgálata is, hogy vajon azok nagy esetszám mellett mennyiben követhetnek normál-, vagy attól eltérő eloszlást. 4.Az AA és a FA heterozigóták kromoszóma instabilitása közötti különbségek megállapításához további genotoxicitási modelleket kell keresnünk. Szignifikancia:*p=0,036, °p=0,0393,ˇp=0,0393