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BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y FERMENTACION MALOLACTICA

BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y FERMENTACION MALOLACTICA. Dra. Mariana Combina Laboratorio de Microbiología Enológica EEA Mendoza -INTA. BAL. Cocos o bacilos. Cocos o bacilos Gram positivos. No Esporulados. Catalasa negativa. REACCION DE CATALASA. 2 H 2 O 2 2 H 2 O + 1 O 2.

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BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y FERMENTACION MALOLACTICA

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Presentation Transcript

  1. BACTERIAS ACIDO LACTICAS Y FERMENTACION MALOLACTICA Dra. Mariana Combina Laboratorio de Microbiología Enológica EEA Mendoza -INTA

  2. BAL Cocos o bacilos

  3. Cocos o bacilos Gram positivos No Esporulados Catalasa negativa

  4. REACCION DE CATALASA 2 H2O2 2 H2O + 1 O2

  5. Propiedades metabólicas y nutricionales comunes Acido láctico Cocos o bacilos Gram positivos No Esporulados Catalasa negativa Anaerobios aerotolerantes (citocromos, heminas)

  6. RELACIONES CON EL OXIGENO Compuestos tóxicos del oxígeno Superóxido O2 peróxido de hidrógeno H2O2 Supeóxido dismutasa 2 O2 + 2 H+ O2 + H2O2 Catalasa 2 H2O2 2 H2O + O2 Peroxidasa C-org. + H2O2 C-O + H2O Mn+2 2Mn+2 + 2 O2 2 MnO2 2 MnO2 MnO2- + O2 + Mn+2

  7. Cocos o bacilos Gram positivos Propiedades metabólicas y nutricionales comunes No Esporulados Catalasa negativa Acido láctico Anaerobios aerotolerantes (citocromos, heminas) Poliauxótrofos

  8. POLIAUXOTROFOS Mn+2 Vitaminas de grupo B aminoácidos bases púricas y pirimidínicas Medios complejos con peptona o Extracto de levadura y azúcar fermentable Acido pantoténico (uva, tomate)

  9. Cocos o bacilos Gram positivos Propiedades metabólicas y nutricionales comunes No Esporulados Catalasa negativa Acido láctico Anaerobios aerotolerantes (citocromos, heminas) Poliauxótrofos Metabolismo homo y heterofermentativo

  10. ADP ATP acetato

  11. Metabolismo Azúcares: monosacáridos pentosas (arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa) hexosas (glucosa, fructosa) disacáridos (sacarosa) Ácidos orgánicos: cítrico, málico y tartárico Alcoholes: glicerol Pentosas se metabolizan por vía pentosa fosfato 1 pentosa 1 lactato + 1 acetato + 2 ATP D-lactico/L-lactico

  12. CLASIFICACION GENERAL Pediococcus cocos 2 planos homoferment. Lactococcus cocos 1 plano homoferment. (Streptococcus) (cadenas) Leuconostoc cocos 1 plano heteroferment. (Oenococcus) Lactobacillus bacilos homo L. mali L. casei (facultativo) hetero L. plantarum L. hilgardii L. fructivorans, otros

  13. BAL están presentes en todas la etapas de la vinificación Uva 103-104 ufc/mL Lb. plantarum Lb. casei Lb. hilgardii (madurez y sanidad uva) Lb. mesenteroides P. damnosus Inicio de FOH 102-103 ufc/mL SO2 Final FOH mantiene bajo (fase latencia-variable) Desarrollo hasta 106-108 ufc/mL Depende de distintos factores (pH, etanol, temperatura, SO2, interacción levadura, autolisis levaduras CO2) Oenococcus oeni y algunos Pediococcus o Lactobacillus

  14. Oenococcus oeni Fructosa Glucosa F6P 2 NADH CO2 Pentosa P ATP acetilP acetato G3P 2 NAD 1 NAD 1 NADH etanol ATP Piruvato lactato 1 NAD 1 ATP 2 ATP En condiciones limitantes de NAD ferm láctica no limitantes de NAD ferm. ácido mixta

  15. Oenococcus oeni Glucosa Fructosa 2 NADH 1 NAD CO2 manitol ribulosa5P ATP acetilP acetato G3P 2 NAD 1 NADH etanol ATP Piruvato lactato acetato 1 NAD + 1 NAD CO2 secuencial Citrato Presencia de otros aceptores externos modifica el metabolismo y estimula el crecimiento

  16. Oenococcus oeni Glucosa 2 NADH CO2 ribulosa5P ATP acetilP G3P Acido acético (0,1-0,2 g/L) Acetoina diacetilo Piruvato Estimula el crecimiento bacteriano pH elevado + acético - diacetilo pH bajo - acético + diacetilo Citrato Zaunmuller, 2006

  17. FML málico-cítrico secuencial?? Necesidad de control una vez finalizada la FML Las bacterias permanecen largo tiempo en vino

  18. Final de degradación del ácido málico Final de degradación del ácido málico Curvas de crecimiento (FML-espontánea) Lavalle La Consulta

  19. FERMENTACION MALOLÁCTICA EN VINOS FML mecanismo adicional de energía (ATP) Membrana + + + + H+ Fuerza protón motriz + - - - + - H+ + Gradiente químico (pH) Potencial eléctrico (cargas + y -) - - El mantenimiento de potencial requiere ATPasa Eflujo de protones requiere ATP Influjo de protones genera ATP

  20. FERMENTACION MALOLÁCTICA EN VINOS Oenococcus oeni Malato - - Malato - - Deben alcanzar 106 cel/mL CO2 alcaliniza y aumenta gradiente de pH lactato Lactato - H+ H+ (simporte) interior exterior ADP H+ H+ Fuerza protón motriz ATP

  21. Modificaciones en el vino- Positivas Acidez Disminuye AT (pH aumenta 0,1-0,3 unidades) Decrece astringencia Aumenta la condensación de taninos Polisacáridos Suaviza Volumen Reducción de los herbáceos Frutales (¿?) damasco,ciruela Madera, roble Manteca y lácteos (diacetilo: 1-4 mg/L) β-glucosidasas en O.oeni Aroma Consumo de azúcares-bacteriocinas FML espont.en botella Estabilidad

  22. Modificaciones en el vino -negativas Elevar AV (0,2-0,3 g/L) Acidez Puede disminuir hasta 30%: Modificación del pH Antocianasa (antocianos glucosilados) Consumo de acetaldehído Color Producción de diacetilo (5-7 mg/L) (puede ser degradado por las levaduras) Manteca Aroma Enmascara aromas varietales Aromas fenolicos y piridinas Aminas biógenas Etil-carbamatos Riesgo

  23. Fermentación maloláctica Depende de factores: Azucares residuales (hexosas, pentosas, acidos orgánicos) Fuentes de nitrógeno: autolisis mantenimiento sobre borras (absorción de compuestos tóxicos para BAL y generación de CO2) azúcares-nitrógeno disponible pH Etanol SO2 Temperatura

  24. Fermentación maloláctica Depende de factores: pH <3,0 no BAL Oenocuccus más R pH crítico: 3,5 (otras BAL) Importante: balance uso azucares y málico (óptimo enzima ML: 3,8 – 60% act: 3,0-3,2) Ensayo pH: 3,15 FML 165 días 3,8 FML 14 días PH bajo: favorece FML y ingreso de málico pH elevado: lenta entrada de málico favorece el uso de azucares aumento AV- picado azúcares-nitrógeno disponible pH Etanol SO2 Temperatura

  25. OH> 10% inhibe la mayoría de BAL Importante: efecto inhibidor se potencia con pH – transporte malico 10% OH/pH 3,3: solo Oenococcus 12% OH/pH 3,2: selección de un m.o. nativo Fermentación maloláctica Depende de factores: azúcares-nitrógeno disponible pH Etanol SO2 Temperatura

  26. Fermentación maloláctica Depende de factores: azúcares-nitrógeno disponible pH Todas las formas de SO2 son activas (+ o -) Dependiente de pH Degrada acetaldehido libera SO2 ligado 10 mg/L libresin problema SO2 30 mg/L libre inhibe Etanol SO2 Temperatura

  27. Fermentación maloláctica Depende de factores: azúcares-nitrógeno disponible pH Etanol Temperatura óptima creci: 28-30 ºC Temperatura óptima FML: 18-20 °C Frío: 10-15ºC crecimiento insuficiente 106 cel/mL de mosto SO2 Temperatura

  28. Factibilidad de FML

  29. Otros factores que afectan la FML Taninos Evidencia en algunos tintos más FML que en otros MERLOT Tendría fracciones tánicas que inhiben FML Antocianos estimulan el crecimiento Taninos inhiben Solo luego de polimerización FML Extracto de vino igual que testigo sin vino Taninos de la piel estimulan Taninos de semilla inhiben (concentrac 10 veces sup.) Taninos de madera estimulan Manoproteínas protegen a BAL de taninos Cabernet Sauvignon no dio igual – Tanah similar

  30. Otros factores que afectan la FML Mantenimiento sobre borras Excesiva clarificación Compactación de borras – mover Carencias nutritivas Nutrición En agua de hidratación (levaduras inactivas, aa, vitaminas, minerales) En vinos difíciles (idem + polisacáridos y celulosa para suspensión) Concentración inicial de acido málico Rango 0,8 a 4 g/L Exceso de oxígeno Debe evitarse al final de la FA

  31. Otros factores que afectan la FML Botriticidas Switch (fluodioxinil+ciprodinil) Residuos de fungicidas Competencia por sustrato SO2 Etanol Acidos grasos (C6-C12) Péptidos Cepa de levadura Adecuada elección de la cepa

  32. Tabla de compatibilidad con la FML

  33. Que hacer para si la FML no se produce Paredes de levaduras Bentonita H2O2 Eliminación de tóxicos Re-inoculación Adecuada elección de la cepa Nutrición Control de temperatura Adaptación de la cepa a las condiciones del vino Test rápido para la FML

  34. Fermentación maloláctica Espontánea Inoculada Impredecible Largos retrasos Costo Riesgo alteración (Brett) FML sp -Aminas biógenas Disminución de la calidad sensorial

  35. Uso de inóculos comerciales Problemas Medio poco favorable Falta de adaptación Bacterias no autóctonas Implantación deficiente Inadecuada activación Optimizar el tiempo de inoculación

  36. Tiempo de inoculación Simultáneamente con las levaduras o tempranamente en la FA Inoculación temprana Inoculación tardía Después de completarse la FA

  37. Co-inoculación – experimentación desde 2004 Objetivo: Evaluar la factibilidad de la co-inoculación en mostos tintos Variables: Distintas cepas de BAL MBR y en diferentes combinaciones con levaduras (paper) Cepas MBR y pre-aclimatadas Tiempo óptimo de inoculación temprana (24 hs y 48 hs) • Impacto sobre: • viabilidad de las levaduras y FA • viabilidad de las BAL y FML. • producción de acido acético • características físico-químicas y organolépticas de los vinos Malbec. • Comparar los resultados obtenidos con co-inoculación con la práctica tradicional de inoculación secuencial (al final de la fermentación alcohólica) utilizando inóculos 1-Step y MBR.

  38. Co-inoculación – ensayos 2007 - Malbec 1 = 3,6 - Malbec 2 = 3,8 D254 + Alpha 1-Step Inoculación simultanea Inoculación secuencial Control MBR 24 y 48hs

  39. Tiempo para alcanzar concentraciones de ácido málico menores a 0,1 g/L en los mostos Malbec 1 y 2 Final FA 13 días

  40. Levaduras y fermentación alcohólica Seguimiento de la fermentación alcohólica realizada en los mostos 1 y 2 por la levadura ICV D254 y la bacteria Uvaferm Alpha 1-Step inoculada en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control MBR inoculada al final de la FA (FA-MBR).

  41. Degradación del ácido L-málico y viabilidad de Saccharomyces cerevisiae (ICV D254) y Oenococcus oeni (Uvaferm Alpha 1-Step y MBR) en el mosto 1 (pH 3,6) en distintos tiempos de inoculación. 24: 1-Step adicionada a las 24 horas, 48: 1-Step adicionada a las 48, FA 1-Step: 1-Step adicionada al final de la FA y FA MBR: cepa MBR adicionada al final de la FA. La línea de puntos indica la población de BAL nativas previas a la inoculación con la cepa comercial

  42. Evaluación del consumo de azúcares

  43. Producción de ácido acético enmostos 1 y 2 fermentados con la levadura ICV D254 inoculados con la bacteria láctica comercial Uvaferm Alpha 1-Step en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control MBR inoculada al final de la FA (FA MBR). Valores físico-químicos finales de los vinos Malbec 1 y 2 fermentados con la levadura ICV D254 y la bacteria Uvaferm Alpha 1-step inoculada en distintos tiempos (24, 48 y FA 1-Step) y su control MBR inoculada al final de la FA (FA MBR).

  44. Conclusiones Los inóculos de bacterias 1-Step previamente aclimatados presentan: • Óptimo comportamiento para ser utilizados en inoculación temprana. • Buena adaptación tanto en mosto como en vino. • Rápida degradación del ácido málico. Parámetros como la viabilidad de las levaduras y performance de la FA no fueron negativamente afectados. En sólo un caso se observó un leve aumento en la acidez volátil final de los vinos comparado con los tratamientos control (dentro de los límites tolerados). El análisis sensorial de los vinos mostró algunas diferencias significativas las cuales en general se presentaron a favor de la inoculación temprana con las cepas pre-aclimatadas

  45. Consideraciones Intentar que la FML finalice conjuntamente con la FA o días después Evaluar el riesgo de las fermentaciones languidecientes Mejor resistencia a los inhibidores (pesticidas) Poco consumo de azucares (ácido D-láctico) Cepas preaclimatadas mas rápidas que cepas de inoculación directa Importante la matriz y la elección de la cepa de levadura Control de población nativa de BAL Desarrollo exitoso de la FML No afecta perfil sensorial o mejora preferencia consumidor

  46. Muchas gracias !!! mcombina@mendoza.inta.gov.ar

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