2006 世界中医药大会论文报告

2006 世界中医药大会论文报告

益气活血法和补肾生髓法对体外培养和脑缺血大鼠神经干细胞增殖分化的影响益气活血法和补肾生髓法对体外培养和脑缺血大鼠神经干细胞增殖分化的影响安徽中医学院王键

研究背景 缺血性脑卒中发病机制、防治措施和康复的研究，一直是国内外基础医学和临床医学研究的重要课题。

目前热点调控NSC的增殖分化，促进中枢再生，促进神经功能恢复、重建目前热点调控NSC的增殖分化，促进中枢再生，促进神经功能恢复、重建中医药疗法能否促进NSC的增殖分化，实现内源性神经功能重建？传统治疗减少神经元的损伤和死亡

神经元 星形胶质细胞少突胶质细胞对称性分裂不对称性分裂对称性分裂 NSC的特性自我更新神经元多向分化潜能星形胶质细胞少突胶质细胞

中医药疗法 • 优势 • 疗效确切 • 毒副作用小 • 多因素作用 • 整体调节 • 在促进脑损伤康复方面具有可靠的临床疗效

对脑髓及与神经干细胞关系的认识 • 《灵枢·海论》：“脑为髓之海。” • 《素问·五藏生成篇》：“诸髓者，皆属于脑。” • 神经干细胞（NSC）是神经再生的基础，是维持脑髓正常功能和结构的重要组成单位。

中医范畴的“脑髓” • 广义上：涵盖神经元、NSC、神经祖细胞、神经胶质细胞、基质细胞、胞外基质等基本结构与功能单位 • 狭义上：含有NSC的脑组织可称之为“脑髓”。

研究假说 有利于脑髓生成、生长发育、保持充满的中医药疗法（益气活血法，补肾生髓法），可能对促进NSC的增殖分化从而促进中枢神经再生起积极作用。

目的 • 探讨两种不同治法对神经干细胞增殖、分化及神经营养因子表达的影响 • 益气活血法，代表方脑络欣通 • 补肾生髓法，代表方左归丸

方法体外培养 • 体外培养胎鼠NSC； • 比较观察脑络欣通和左归丸药物血清对胎鼠NSC的促增殖分化效应。

在体探查 • 在体制作大鼠急性MCAO再灌注损伤模型； • 比较观察脑络欣通和左归丸对脑缺血大鼠脑内NSC的促增殖分化效应。

阳性细胞表达：免疫组化免疫荧光 • Nestin、BrdU染色—NSC的增殖 • BrdU/GFAP、 BrdU/NSE双标染色—NSC的分化 • BDNF和bFGF显色—神经营养因子表达

离体实验脑络欣通和左归丸药物血清对体外培养的大鼠神经干细胞增殖分化的影响离体实验脑络欣通和左归丸药物血清对体外培养的大鼠神经干细胞增殖分化的影响

1-1 1-2 1-3 1-4 1-5 1-6 NSC的分离培养和鉴定图1-1 第1d悬浮小细胞球 (10×10) 图1-2 正在分裂的细胞 (20×10) 图1-3 大细胞球 (20×10) 图1-4 贴壁细胞发出突起 (20×10) 图1-5 细胞网络 (10×10) 图1-6 细胞球 Nestin阳性 (Cy3, 20×10) Nestin

BrdU NSE 图1-7 BrdU阳性细胞 (Cy3, 20×10) 图1-8 NSE阳性细胞 (Cy3, 20×10) 图1-9 NSE阳性细胞 (Cy3, 20×10) 图1-10 GFAP阳性细胞 (Cy3, 40×10) 图1-11 GFAP阳性细胞 (FITC, 20×10) 图1-12 Gal-c阳性细胞 (FITC, 40×10) 1-8 1-7 NSE GFAP GFAP 1-10 1-9 1-10 GFAP Gal-c 1-11 1-12

Nestin Nestin 图2-1 第2d，Nestin阳性细胞球(Cy3, 20×10) 图2-2 第3d，Nestin阳性细胞球(Cy3, 20×10) 图2-3 第5d，细胞球突起连接，构成细胞网络(20×10) 图2-4 第5d空白血清组NSC球突起(20×10) 图2-5 第5d脑络欣通组NSC球突起 (20×10) 图2-6 第5d左归丸组NSC球突起 (20×10) 2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6

MAP-2 GFAP 第7d，各组分化的　　　阳性细胞　图2-7，2-9，2-11为MAP-2阳性细胞 (Cy3, 20×10) 　图2-8，2-10，2-12为GFAP阳性细胞 (FITC, 20×10) 2-7 2-8 Control Control MAP-2 GFAP 2-9 2-10 NLXT NLXT MAP-2 GFAP 2-11 2-12 ZGW ZGW

**p <0.01 vs Control; ▲▲ p <0.01 vs Naoluoxintong Fig.2-1 Changes of process length of neurosphere in 3 groups in the fifth day

**p <0.01 vs Control; ▲ p<0.05 vs Naoluoxintong Fig. 2-2 Rate of differentiated cells in 3 groups

离体实验结果 • 脑络欣通和左归丸药物血清均可诱导 NSC分化和增殖 • 前者诱导分化的神经元发育较成熟，后者促增殖效应较为显著

在体实验 脑络欣通和左归丸对脑缺血再灌注损伤大鼠内源性神经干细胞增殖分化的影响

脑络欣通和左归丸对大鼠脑缺 血损伤后神经干细胞增殖的影响——BrdU表达

NLXT 3d NLXT 7d NLXT 3d ZGW 3d ZGW 3d ZGW 7d 缺血侧海马BrdU免疫阳性细胞（Cy3，20×10） NLXT 7d ZGW 7d

NLXT 3d ZGW 3d NLXT 3d NLXT 7d ZGW 3d ZGW 7d NLXT 7d ZGW7d 缺血侧脑室下区 BrdU免疫阳性细胞（Cy3，20×10）

NLXT 3d ZGW 3d NLXT 3d NLXT 7d ZGW 3d ZGW 7d NLXT 7d ZGW 7d 缺血侧脑区BrdU免疫阳性细胞（Cy3，20×10）

脑络欣通和左归丸对大鼠脑缺 血损伤后神经干细胞增殖的影响——Nestin表达

NLXT 1d NLXT 3d NLXT 7d 额顶叶皮质额顶叶皮质 SVZ ZGW 1d ZGW 3d ZGW 3d ZGW 7d 室管膜及SVZ 额顶叶皮质脑区缺血侧脑组织Nestin染色（SABC，40×10）

脑络欣通和左归丸对大鼠脑缺 血损伤后NSC分化的影响

M1d NLXT 3d NLXT 3d ZGW 3d 缺血侧脑组织BrdU/GFAP双标阳性细胞（FITC，Cy3，40×10）

NLXT 7d NLXT 7d ZGW 7d ZGW 7d 缺血侧脑组织BrdU/NSE双标阳性细胞（FITC，Cy3，40×10）

NLXT 7d NLXT 7d ZGW 7d ZGW 7d 缺血侧海马BrdU/GFAP、BrdU/NSE双标阳性细胞（FITC，Cy3，40×10）

在体实验结果 • 脑络欣通和左归丸均能改善脑缺血损伤; • 脑络欣通和左归丸均能促进脑内Nestin、BrdU、BrdU/GFAP、 BrdU/NSE、BDNF和bFGF表达。 • 前者改善脑缺血，促BDNF、BrdU/GFAP、 BrdU/NSE表达作用明显； • 后者促bFGF、Nestin、BrdU表达作用较显著。

结论 • 脑络欣通和左归丸均能够促进体内外NSC增殖、分化； • 其效应可能与促进相关神经营养因子的表达有关； • 两者效应有一定差异。

What we see is “Tip of the unreported iceberg” THANKS！

南新安，北华佗

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