Le tribolazioni di una proteina di membrana

1. b6 IV FeS cyt f Francesca Zito IBPC CNRS UMR 7099 Le tribolazioni di una proteina di membrana

2. Le proteine di membrana costituiscono il 20-30% dei genomi completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida genoma unano: 40-60 000 geni 60-70 % proteine solubili 30-40 % Proteine di membrana ~ 6000 strutture ~ 20 strutture

3. RMN Biochimica Cristallografia Genetica molecolare Fd E C D struttura H G J M K I L P700 funzione N F PC Biochimica Spettroscopia

4. PQ PQ PQ Fd PSII ATP ADP + Pi a b d b a b a e II I g E C D CP43 CP47 D1 D2 A B Qi A0 bh III III III III III IV IV-cyt b6 Lhcbi Lhcbi M G L X M J K W I E F L H N H G J M K I L Lhcbi Qo bl P700 R O N ISP F P T PC 3 H+ Q CP43 CP47 cyt f 2 H2O 4H+ + O2 PC ATPsynthase cyt b6f PSI

5. PQ PQ ATP ADP + Pi d II I b6 IV L bl FeS Q F P 3 H+ cyt f 2 H2O 4H+ + O2 Antennes PSII cyt b6f PSI ATPsynthase (mitochondrie)

6. C N C N C stroma C C C L N f b6 b6 b6 b6 IV G M IV IV Rieske lumen N N N N C

7. Cytochrome c oxidase PS I Complex I + PS II 2H stromal cytb6+IV/cytb in - e Q QH b H 2 [function : b6 f & bc1] - e - e b QH QH L 2 2 out - - e + luminal e 2H PC cyt - e Rieske cyt f/c 1

8. + H - e PS I + PS II 2H cytb6+IV Kinase ? - e State transitions Q QH b 2 H [function : b6fvs.bc1] - e - e b QH QH L 2 2 - - e + e 2H PC cytc - e Rieske + cyt f H

9. + H - e PS I ? PS II + 2H ? - e in Q QH b 2 H - e - e b QH QH L 2 2 - out - e + e 2H PC cyt Rieske Cyt f + H

10. Institut de Biologie Physico-Chimique UMR 7099, CNRS/Université Paris-7 l l l l l f R b6IV4 kDa SDS-PAGE analysisof Chlamydomonasb6f complex purified in Hecameg/egg PC mixed micelles (TMBZ + silver)

11. Institut de Biologie Physico-Chimique UMR 7099, CNRS/Université Paris-7 l l l l l f R b6IV4 kDa subIV PetG PetL PetM PetN cytb6 N C N C C C N stroma C C ) x 2 bH β-car. A D B C bL Chla N N N C lumen N Fe2S2 Rieske protein cytf

12. Institut de Biologie Physico-Chimique UMR 7099, CNRS/Université Paris-7 l l l l l f R b6IV4 kDa subIV PetG PetL PetM PetN cytb6 N C stroma N C C C N C C bH β-car. A D B C bL Chla N N N C lumen N Fe2S2 Rieske protein cytf homology to bc1

13. Institut de Biologie Physico-Chimique UMR 7099, CNRS/Université Paris-7 subIV PetG PetL PetM PetN cytb6 N C stroma N C C C N C C bH β-car. A D B C bL Chla N N N C lumen N Fe2S2 Rieske protein cytf homology to bc1 structure solved

14. Cristallizazione di una proteina di membrana Solubilizzazione e Purificazione - Détergente + Détergente Aggregazione Dissociazione Manipolazione in soluzione Cristallizazione

15. Institut de Biologie Physico-Chimique UMR 7099, CNRS/Université Paris-7 EM on 2D crystals 3D crystals 100 µm Crystals from Hecameg/PC solution Cryo-EM projection map (Stroebel & Picot, unpublished) (Breyton, 2000)

16. b6 f Purificazione del complesso selvatico Risultato della purificazione: - Pura, actifttiva. - 3mg/ 20ml di membrane.  Particolarità: - Presenza di lipidi esogeni con ruolo stabilizzatore - Variabilità. - Difficile da modificare (hydroxylapatite) Hécameg-lipides à 4°C Solubilisation 25mM HG Gradient de saccharose 20mM Hécameg + 0.1 g/l lipides Colonne d’hydroxylapatite Ref.: Pierre et coll (1995) J. Biol. Chem. 270, 29342-29349.

17. Cristalli piccoli e difficili da riprodurre 100 mm Ago in fase cubica 100 mm Ref.: E. Landau & J. Rosenbuch (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14532-14535.

18. Institut de Biologie Physico-Chimique UMR 7099, CNRS/Université Paris-7 His6 subIV PetG PetL PetM PetN cytb6 N C stroma N C C C N C C bH β-car. A D B C bL Chla N N N C lumen N Fe2S2 Rieske protein cytf

19. Purificazione di un complesso portante un etichetta poli-istidina Solubilisation Risultato della purificazione: - Pura, attiva. - 2mg /20ml di membrane.  Particolarità: - Possibilità di lavorare senza lipidi esogeni. - Risultati riproduttibili. - Protocollo rapido e flessibile - Cristalli dopo 4 giorni Colonne d’échange d’ions b6 f FPLC Colonne de nickel b6 f FPLC Colonne de dessalage FPLC

20. 500 µm 400 µm 500 µm Cristallisation Cyt f Rieske Cyt b6 SuIV pt su SDS-PAGE di un cristallo 100 mm

21. b6 IV FeS cyt f Purificazione in hecameg i cristalli non ci soddisfano H Purificazione su colonna di affinità Buoni cristalli! b6 IV FeS cyt f

22. Institut de Biologie Physico-Chimique UMR 7099, CNRS/Université Paris-7 400 µm Crystal grown from C12-M solution in the presence of C13-stigmatellin

23. Institut de Biologie Physico-Chimique UMR 7099, CNRS/Université Paris-7 ~200 µm Crystal in cryo-loopDiffraction pattern (ESRF line BM30A)

24. H b6 IV b6 IV FeS 3,1 Å FeS cyt f cyt f 100 mm

26. stroma lumen

28. 115 Å

29. bH bL Fe2S2 f

30. bH bL Fe2S2 c1 f ~16 Å --- b6 f --- bc1

31. Rieske TMH Cyt f TMH PetL B PetN b6 A E 4-kDa subunits PetM PetG C D F IV G Cytochrome b6f transmembrane region – view from the lumen side

32. bc1 G QP-C H F IX Rieske f c1 PetL D B PetN A E C PetG b6f [transmembrane helices, b6f + bc1] PetM PetM PetG E PetN C A B PetL f D c1 Rieske IX F QP-C H G --- Chlamydomonasb6 f --- yeast bc1(1KB9 ; Lange et al., EMBO J. 20:6591, 2001)

34. chlorophyll a 2 Fo – Fc (contouring at1 σ)

35. MGDG

36. chlorophyll a C13-stigmatellin

37. -carotene

39. Cys35