Presentaci

4. Tipos de enzimas de restricción Sistemas tipo I Una sola enzima (multimérica que posee 3 subunidades) reconoce la secuencia específica de ADN, metila y restringe. Pero la restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento. Sistemas tipo II Enzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó adyacente. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en genética molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos, y así, recuperar secuencias conocidas. Sistemas tipo III Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas, y rompen el DNA 25-27 bp, más allá del sitio de reconocimiento. Tipos de enzimas de restricción Sistemas tipo I Una sola enzima (multimérica que posee 3 subunidades) reconoce la secuencia específica de ADN, metila y restringe. Pero la restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento. Sistemas tipo II Enzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó adyacente. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en genética molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos, y así, recuperar secuencias conocidas. Sistemas tipo III Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas, y rompen el DNA 25-27 bp, más allá del sitio de reconocimiento.

7. Geles de agarosa El agar-agar es un polímero de origen natural que se extrae de determinadas algas rojas, por ejemplo de Gelidium. Es un polímero lineal formado por la repetición de unidades del disacárido agarobiosa, cuya estructura es: -(1-3)-b-D-Galactosa-(1-4)[3,6 anhidro]-a-L-galactosa- Las cadenas resultantes son de longitud elevada. Se ha estimado que su peso molecular medio es del orden de 120000, es decir, alrededor de unas 400 unidades del disacárido fundamental. Puede presentar grupos sulfato, piruvato o metoxilo en mayor o menor grado. Tanto el grado de sustitución como la longitud media de las moléculas de polímero influyen en las propiedades físicas de los geles resultantes. El agar natural se puede fraccionar mediante precipitación selectiva en dos constituyentes, uno relativamente libre de sustituyentes aniónicos, conocido como agarosa, y una fracción rica en dichos sustituyentes, la agaropectina. Para geles de electroforesis se emplea exclusivamente agarosa. Este polisacárido forma geles termoreversibles en agua o en soluciones salinas, de consistencia notable incluso a muy baja concentración del polímero: es posible formar geles mecánicamente estables con tan sólo un 0,4% en peso de agarosa en agua. El proceso de gelificación ocurre a temperaturas notablemente más bajas que el de fusión del gel: existe una elevada histéresis térmica. Por ejemplo, la Agarosa M de Amersham Biosciences presenta una temperatura de gelificación (una vez disuelta en agua) de 40-43ºC, y una temperatura de fusión de 90ºC. La presencia de grupos aniónicos en la agarosa presenta el problema de que se pueden presentar niveles elevados de electroendósmosis. Este fenómeno resulta en un flujo neto de agua hacia el cátodo, con lo que se distorsiona tanto el movimiento de la muestra como la estructura del propio gel. Es posible encontrar agarosas comerciales con diferentes niveles de sustitución y, por consiguiente, con diferentes niveles de electroendósmosis y de temperatura de gelificación. Los geles de agarosa se forman porque las cadenas del polímero se unen entre sí formando una red tridimensional rígida, que mantiene unidas las moléculas de agua mediante puentes de hidrógeno. Las cadenas de polímero se asocian por puentes de hidrógeno formando hélices dobles. Estas hélices dobles se asocian a su vez en grupos de 10 a 20 formando suprafibras helicoidales que confieren rigidez al gel; se ha estimado que el radio de estas fibras es del orden de 24 nm [1]. Estos haces rígidos no son continuos, sino que se interrumpen formando nodos en los que se intercambian las hélices de varios haces [2]. Los poros resultantes son relativamente grandes, pero el gel no colapsa debido a la rigidez de los haces de fibras de agarosa. El gel se funde cuando la agitación térmica es suficientemente elevada para desorganizar esta estructura tridimensional, quedando una disolución viscosa de polímeros desorganizados. Los geles de agarosa son estructuras a la vez rígidas y con poros de gran tamaño, que permiten que el gel sea atravesado por moléculas grandes, cuyo radio hidrodinámico efectivo sea del orden de 3 a 10 nm, tales como ácidos nucleicos, lipoproteínas, o partículas víricas. El tamaño de los poros depende inversamente de la concentración de agarosa; es posible formar geles útiles para electroforesis empleando cantidades de agarosa comprendidas, aproximadamente, desde el 0,4% en peso hasta el 5%. No resulta práctico emplear concentraciones superiores de agarosa ya que los geles resultan poco elásticos y difícilmente manejables y se sustituyen con ventaja por los geles de poliacrilamida. Sin embargo, para la electroforesis de ácidos nucleicos los geles de agarosa son absolutamente insustituibles. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de fragmentos de ADN de 500 a 20.000 pares de bases. Geles de agarosa El agar-agar es un polímero de origen natural que se extrae de determinadas algas rojas, por ejemplo de Gelidium. Es un polímero lineal formado por la repetición de unidades del disacárido agarobiosa, cuya estructura es: -(1-3)-b-D-Galactosa-(1-4)[3,6 anhidro]-a-L-galactosa- Las cadenas resultantes son de longitud elevada. Se ha estimado que su peso molecular medio es del orden de 120000, es decir, alrededor de unas 400 unidades del disacárido fundamental. Puede presentar grupos sulfato, piruvato o metoxilo en mayor o menor grado. Tanto el grado de sustitución como la longitud media de las moléculas de polímero influyen en las propiedades físicas de los geles resultantes. El agar natural se puede fraccionar mediante precipitación selectiva en dos constituyentes, uno relativamente libre de sustituyentes aniónicos, conocido como agarosa, y una fracción rica en dichos sustituyentes, la agaropectina. Para geles de electroforesis se emplea exclusivamente agarosa. Este polisacárido forma geles termoreversibles en agua o en soluciones salinas, de consistencia notable incluso a muy baja concentración del polímero: es posible formar geles mecánicamente estables con tan sólo un 0,4% en peso de agarosa en agua. El proceso de gelificación ocurre a temperaturas notablemente más bajas que el de fusión del gel: existe una elevada histéresis térmica. Por ejemplo, la Agarosa M de Amersham Biosciences presenta una temperatura de gelificación (una vez disuelta en agua) de 40-43ºC, y una temperatura de fusión de 90ºC. La presencia de grupos aniónicos en la agarosa presenta el problema de que se pueden presentar niveles elevados de electroendósmosis. Este fenómeno resulta en un flujo neto de agua hacia el cátodo, con lo que se distorsiona tanto el movimiento de la muestra como la estructura del propio gel. Es posible encontrar agarosas comerciales con diferentes niveles de sustitución y, por consiguiente, con diferentes niveles de electroendósmosis y de temperatura de gelificación. Los geles de agarosa se forman porque las cadenas del polímero se unen entre sí formando una red tridimensional rígida, que mantiene unidas las moléculas de agua mediante puentes de hidrógeno. Las cadenas de polímero se asocian por puentes de hidrógeno formando hélices dobles. Estas hélices dobles se asocian a su vez en grupos de 10 a 20 formando suprafibras helicoidales que confieren rigidez al gel; se ha estimado que el radio de estas fibras es del orden de 24 nm [1]. Estos haces rígidos no son continuos, sino que se interrumpen formando nodos en los que se intercambian las hélices de varios haces [2]. Los poros resultantes son relativamente grandes, pero el gel no colapsa debido a la rigidez de los haces de fibras de agarosa. El gel se funde cuando la agitación térmica es suficientemente elevada para desorganizar esta estructura tridimensional, quedando una disolución viscosa de polímeros desorganizados. Los geles de agarosa son estructuras a la vez rígidas y con poros de gran tamaño, que permiten que el gel sea atravesado por moléculas grandes, cuyo radio hidrodinámico efectivo sea del orden de 3 a 10 nm, tales como ácidos nucleicos, lipoproteínas, o partículas víricas. El tamaño de los poros depende inversamente de la concentración de agarosa; es posible formar geles útiles para electroforesis empleando cantidades de agarosa comprendidas, aproximadamente, desde el 0,4% en peso hasta el 5%. No resulta práctico emplear concentraciones superiores de agarosa ya que los geles resultan poco elásticos y difícilmente manejables y se sustituyen con ventaja por los geles de poliacrilamida. Sin embargo, para la electroforesis de ácidos nucleicos los geles de agarosa son absolutamente insustituibles. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de fragmentos de ADN de 500 a 20.000 pares de bases.

16. Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad. La polimerización se inicia por la formación de radicales libres en el medio, lo que se logra mediante la adición al medio de los generalmente llamados catalizadores, aunque más correcto sería denominarlos iniciadores del proceso. Se suelen emplear los siguientes: 1) Persulfato amónico, que al disolverlo en agua en presencia de una base débil se disocia originando un radical libre. 2) Riboflavina o riboflavina-5-fosfato, que en presencia de luz ultravioleta de longitud de onda larga (sirve la emitida por una lámpara fluorescente) y trazas de oxígeno origina radicales libres. En este caso, se mezcla la riboflavina con la disolución de monómero y la reacción se inicia iluminando dicha disolución (fotopolimerización). En ambos casos se añade además una amina que favorezca la formación de radicales libres. Se suele emplear la N,N,N',N' tetrametiletilendiamina (TEMED) Las concentraciones óptimas de persulfato amónico y TEMED dependen de la concentración de acrilamida; vienen a estar entre 1 y 10 mM. Una concentración demasiado baja puede traducirse en que parte del monómero no polimerice; por el contrario, un exceso de catalizador origina un número elevado de cadenas de acrilamida anormalmente cortas. En ambos casos, las propiedades del gel como matriz para electroforesis se resienten. La cinética de la polimerización al emplear persulfato es rápida; se inicia a los pocos minutos y se puede considerar completamente terminada entre 1 a 2 horas de su inicio. El tiempo concreto depende directamente de la temperatura y, como cabría esperar, de la concentración de acrilamida, siendo la polimerización más rápida cuanto mayor sea ésta. Aunque se ha propuesto el polimerizar la acrilamida a 4° para controlar las características del gel, a esta temperatura la reacción es excesivamente lenta; la temperatura óptima de polimerización está entre 20° y 30°C. Si el gel no se forma en un tiempo superior a una hora, o la polimerización ocurre demasiado rápidamente el gel debe desecharse, ya que en esas condiciones la polimerización es irregular y el gel presenta inhomogeneidades que afectan a la separación. La fotopolimerización es sensiblemente más lenta, requiriendo periodos mínimos de unas 10 horas de iluminación para alcanzar un grado de polimerización superior al 95% del monómero presente inicialmente. La polimerización se detiene cuando desaparecen los radicales libres del medio; entre los agentes que producen su desaparición con mayor eficacia se encuentra el oxígeno molecular, por lo que todas las disoluciones se deben desgasificar enérgicamente antes de formar el gel. Por esto también es preciso aislar del contacto del aire todas las superficies de la disolución de monómero, ya que el oxígeno de la atmósfera, al difundirse, inhibe fuertemente la polimerizacion; lo mismo ocurre con las posibles burbujas de aire atrapadas en la disolución. La reacción de polimerización es exotérmica, y se lleva a cabo con contracción de volumen; este efecto es más marcado cuanto mayor es la concentración de acrilamida. La polimerización de la acrilamida sola no origina un gel, sino una especie de goma que es una disolución muy viscosa de largas cadenas lineales de poliacrilamida. Para que se forme un gel propiamente dicho es necesario que se creen uniones covalentes entre esas cadenas; para ello se añade al medio una molécula capaz de formar puentes cruzados. La más utilizada es la N,N' metilén-bis-acrilamida (BIS), por su capacidad de integrarse simultáneamente en dos cadenas en crecimiento. Se han empleado otros compuestos similares a la bis-acrilamida, pero ninguno ha alcanzado la popularidad de ésta. Los geles de poliacrilamida son geles neutros en el sentido de que no existen grupos cargados en las fibras de polímero si la disolución de acrilamida ha sido preparada recientemente. En caso contrario, y dado que en disolución acuosa se produce la hidrólisis espontánea del grupo amida, quedarían integrados en la estructura del gel restos carboxilo del ácido acrílico que alteran la separación electroforética al interaccionar con las moléculas de muestra o de disolvente. Los geles de poliacrilamida son estables excepto a valores de pH extremos; a pH muy básico aumentan de volumen y terminan descomponiéndose. El grado de hidratación del gel depende en parte del pH y de la fuerza iónica del medio. Cambios importantes en estos parámetros alteran la estructura del gel, pudiendo producirse artefactos durante la electroforesis. Las disoluciones acuosas de acrilamida y de BIS son estables durante uno o dos meses, guardadas a 4° y en ausencia de luz. Las disoluciones de persulfato, sin embargo, sólo son estables durante pocos días; lo mejor es prepararlas inmediatamente antes de su uso. ATENCION: Tanto la acrilamida como la BIS son potentes neurotoxinas, capaces de actuar por ingestión o contacto (LD50 para el ratón, 170 mg.Kg-1). Una vez polimerizados los geles resultan inofensivos, pero es preciso adoptar precauciones para evitar entrar en contacto con las disoluciones del monómero o con monómeros no polimerizados que hubieran podido quedar en el gel. Los geles de poliacrilamida se forman por polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad. La polimerización se inicia por la formación de radicales libres en el medio, lo que se logra mediante la adición al medio de los generalmente llamados catalizadores, aunque más correcto sería denominarlos iniciadores del proceso. Se suelen emplear los siguientes: 1) Persulfato amónico, que al disolverlo en agua en presencia de una base débil se disocia originando un radical libre. 2) Riboflavina o riboflavina-5-fosfato, que en presencia de luz ultravioleta de longitud de onda larga (sirve la emitida por una lámpara fluorescente) y trazas de oxígeno origina radicales libres. En este caso, se mezcla la riboflavina con la disolución de monómero y la reacción se inicia iluminando dicha disolución (fotopolimerización). En ambos casos se añade además una amina que favorezca la formación de radicales libres. Se suele emplear la N,N,N',N' tetrametiletilendiamina (TEMED) Las concentraciones óptimas de persulfato amónico y TEMED dependen de la concentración de acrilamida; vienen a estar entre 1 y 10 mM. Una concentración demasiado baja puede traducirse en que parte del monómero no polimerice; por el contrario, un exceso de catalizador origina un número elevado de cadenas de acrilamida anormalmente cortas. En ambos casos, las propiedades del gel como matriz para electroforesis se resienten. La cinética de la polimerización al emplear persulfato es rápida; se inicia a los pocos minutos y se puede considerar completamente terminada entre 1 a 2 horas de su inicio. El tiempo concreto depende directamente de la temperatura y, como cabría esperar, de la concentración de acrilamida, siendo la polimerización más rápida cuanto mayor sea ésta. Aunque se ha propuesto el polimerizar la acrilamida a 4° para controlar las características del gel, a esta temperatura la reacción es excesivamente lenta; la temperatura óptima de polimerización está entre 20° y 30°C. Si el gel no se forma en un tiempo superior a una hora, o la polimerización ocurre demasiado rápidamente el gel debe desecharse, ya que en esas condiciones la polimerización es irregular y el gel presenta inhomogeneidades que afectan a la separación. La fotopolimerización es sensiblemente más lenta, requiriendo periodos mínimos de unas 10 horas de iluminación para alcanzar un grado de polimerización superior al 95% del monómero presente inicialmente. La polimerización se detiene cuando desaparecen los radicales libres del medio; entre los agentes que producen su desaparición con mayor eficacia se encuentra el oxígeno molecular, por lo que todas las disoluciones se deben desgasificar enérgicamente antes de formar el gel. Por esto también es preciso aislar del contacto del aire todas las superficies de la disolución de monómero, ya que el oxígeno de la atmósfera, al difundirse, inhibe fuertemente la polimerizacion; lo mismo ocurre con las posibles burbujas de aire atrapadas en la disolución. La reacción de polimerización es exotérmica, y se lleva a cabo con contracción de volumen; este efecto es más marcado cuanto mayor es la concentración de acrilamida. La polimerización de la acrilamida sola no origina un gel, sino una especie de goma que es una disolución muy viscosa de largas cadenas lineales de poliacrilamida. Para que se forme un gel propiamente dicho es necesario que se creen uniones covalentes entre esas cadenas; para ello se añade al medio una molécula capaz de formar puentes cruzados. La más utilizada es la N,N' metilén-bis-acrilamida (BIS), por su capacidad de integrarse simultáneamente en dos cadenas en crecimiento. Se han empleado otros compuestos similares a la bis-acrilamida, pero ninguno ha alcanzado la popularidad de ésta. Los geles de poliacrilamida son geles neutros en el sentido de que no existen grupos cargados en las fibras de polímero si la disolución de acrilamida ha sido preparada recientemente. En caso contrario, y dado que en disolución acuosa se produce la hidrólisis espontánea del grupo amida, quedarían integrados en la estructura del gel restos carboxilo del ácido acrílico que alteran la separación electroforética al interaccionar con las moléculas de muestra o de disolvente. Los geles de poliacrilamida son estables excepto a valores de pH extremos; a pH muy básico aumentan de volumen y terminan descomponiéndose. El grado de hidratación del gel depende en parte del pH y de la fuerza iónica del medio. Cambios importantes en estos parámetros alteran la estructura del gel, pudiendo producirse artefactos durante la electroforesis. Las disoluciones acuosas de acrilamida y de BIS son estables durante uno o dos meses, guardadas a 4° y en ausencia de luz. Las disoluciones de persulfato, sin embargo, sólo son estables durante pocos días; lo mejor es prepararlas inmediatamente antes de su uso. ATENCION: Tanto la acrilamida como la BIS son potentes neurotoxinas, capaces de actuar por ingestión o contacto (LD50 para el ratón, 170 mg.Kg-1). Una vez polimerizados los geles resultan inofensivos, pero es preciso adoptar precauciones para evitar entrar en contacto con las disoluciones del monómero o con monómeros no polimerizados que hubieran podido quedar en el gel.

17. D/L The distance of the center of the protein binding site from the 5' end of the fragment was divided by the total length of the probe (flexure displacement D/L). D/L The distance of the center of the protein binding site from the 5' end of the fragment was divided by the total length of the probe (flexure displacement D/L).

19. The plasmid pBR322 is one of the most commonly used E.coli cloning vectors. pBR322 is 4361 bp in length and contains: (1) the replicon rep responsible for the replication of plasmid (source - plasmid pMB1); (2) rop gene coding for the Rop protein, which promotes conversion of the unstable RNA I - RNA II complex to a stable complex and serves to decrease copy number (source - plasmid pMB1); (3) bla gene, coding for beta-lactamase that confers resistance to ampicillin (source - transposon Tn3); (4) tet gene, encoding tetracycline resistance protein (source - plasmid pSC101). The circular sequence is numbered such that 1 is the first T of the unique EcoRI site GAATTC and the count increases first through the tet gene, the pMB1 material, and finally through the Tn3 region. The map shows enzymes that cut pBR322 DNA once. Enzymes produced by Fermentas are shown in blue. The coordinates refer to the position of first nucleotide in each recognition sequence. The exact position of genetic elements is shown on the map (termination codons included). The bla gene nucleotides 4153-4085 (complementary strand) code for a signal peptide. The indicated rep region is sufficient to promote replication. DNA replication initiates at position 2533 (+/- 1) and proceeds in the direction indicated. Plasmids carrying the pMB1 and ColE1 replicons are incompatible, but they are fully compatible with those carrying the p15A replicon (pACYC177, pACYC184). pMB1-derived plasmids can be amplified using chloramphenicol. The plasmid pBR322 is one of the most commonly used E.coli cloning vectors. pBR322 is 4361 bp in length and contains: (1) the replicon rep responsible for the replication of plasmid (source - plasmid pMB1); (2) rop gene coding for the Rop protein, which promotes conversion of the unstable RNA I - RNA II complex to a stable complex and serves to decrease copy number (source - plasmid pMB1); (3) bla gene, coding for beta-lactamase that confers resistance to ampicillin (source - transposon Tn3); (4) tet gene, encoding tetracycline resistance protein (source - plasmid pSC101). The circular sequence is numbered such that 1 is the first T of the unique EcoRI site GAATTC and the count increases first through the tet gene, the pMB1 material, and finally through the Tn3 region. The map shows enzymes that cut pBR322 DNA once. Enzymes produced by Fermentas are shown in blue. The coordinates refer to the position of first nucleotide in each recognition sequence. The exact position of genetic elements is shown on the map (termination codons included). The bla gene nucleotides 4153-4085 (complementary strand) code for a signal peptide. The indicated rep region is sufficient to promote replication. DNA replication initiates at position 2533 (+/- 1) and proceeds in the direction indicated. Plasmids carrying the pMB1 and ColE1 replicons are incompatible, but they are fully compatible with those carrying the p15A replicon (pACYC177, pACYC184). pMB1-derived plasmids can be amplified using chloramphenicol.

34. transformación Transformar una bacteria ó una levadura, consiste en introducirle una molécula de ADN extranjero. Para las células eucariotas (salvo las levaduras), no se dice transformar pero transfectar (transformar una célula eucariota quiere decir hacerla eterna o hacerla cancerosa). Existen varios métodos para introducir un plásmido en una célula. Cada uno es en sí una receta y cada uno tiene una propia. Transformación con CaCl2 + choque térmico: Consiste en añadir plásmidos a las bacterias tratadas con CaCl2 y de someterlas a un breve choque térmico (42°C). La utilización de otras sales de CaCl2 y la adición de iones metálicos aumenta la eficiencia de la transformación. Para plásmidos de 3 kb, una transformación eficáz produce alrededor de 10+8 colonias/mg de ADN plasmídico superenrollado. Electroporación: Es un procedimiento que consiste en someter las bacterias suspendidas en agua a una diferencia de potencial elevado para perforar temporalmente la pared celular. Otros métodos de transformación: Utilizan por ejemplo liposomas y son más costosos. La eficiencia de la transformación es inversamente proporcional a la talla del plásmido. Para identificar las bacterias transformadas, se utilizan marcadores de selección proporcionados por plásmidos. Los marcadores de selección más utilizados son los gens de resistencia a antibióticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina. Como regla, las bacterias transformadas se cultivan en presencia del antibiótico para evitar que la bacteria pierda el plásmido que se le ha introducido. transformación Transformar una bacteria ó una levadura, consiste en introducirle una molécula de ADN extranjero. Para las células eucariotas (salvo las levaduras), no se dice transformar pero transfectar (transformar una célula eucariota quiere decir hacerla eterna o hacerla cancerosa). Existen varios métodos para introducir un plásmido en una célula. Cada uno es en sí una receta y cada uno tiene una propia. Transformación con CaCl2 + choque térmico: Consiste en añadir plásmidos a las bacterias tratadas con CaCl2 y de someterlas a un breve choque térmico (42°C). La utilización de otras sales de CaCl2 y la adición de iones metálicos aumenta la eficiencia de la transformación. Para plásmidos de 3 kb, una transformación eficáz produce alrededor de 10+8 colonias/mg de ADN plasmídico superenrollado. Electroporación: Es un procedimiento que consiste en someter las bacterias suspendidas en agua a una diferencia de potencial elevado para perforar temporalmente la pared celular. Otros métodos de transformación: Utilizan por ejemplo liposomas y son más costosos. La eficiencia de la transformación es inversamente proporcional a la talla del plásmido. Para identificar las bacterias transformadas, se utilizan marcadores de selección proporcionados por plásmidos. Los marcadores de selección más utilizados son los gens de resistencia a antibióticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina. Como regla, las bacterias transformadas se cultivan en presencia del antibiótico para evitar que la bacteria pierda el plásmido que se le ha introducido.

35. Para identificar las bacterias transformadas, se utilizan marcadores de selección proporcionados por plásmidos. Los marcadores de selección más utilizados son los gens de resistencia a antibióticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina. Como regla, las bacterias transformadas se cultivan en presencia del antibiótico para evitar que la bacteria pierda el plásmido que se le ha introducido. Fig. 2. Análisis de restricción con la enzima BamH1 de los plásmidos purificados a partir de los transformantes obtenidos. Línea 1: plásmido pcDNA3 digerido con la enzima BamH1. Líneas 2, 3, 4, 5, 8 y 11: plásmidos con insertos de ADN de T.cruzi. Líneas 6, 7, 9 y 10: vectores no recombinantes. Para identificar las bacterias transformadas, se utilizan marcadores de selección proporcionados por plásmidos. Los marcadores de selección más utilizados son los gens de resistencia a antibióticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina. Como regla, las bacterias transformadas se cultivan en presencia del antibiótico para evitar que la bacteria pierda el plásmido que se le ha introducido. Fig. 2. Análisis de restricción con la enzima BamH1 de los plásmidos purificados a partir de los transformantes obtenidos. Línea 1: plásmido pcDNA3 digerido con la enzima BamH1. Líneas 2, 3, 4, 5, 8 y 11: plásmidos con insertos de ADN de T.cruzi. Líneas 6, 7, 9 y 10: vectores no recombinantes.