实验六 茶多糖的制备和红外光谱分析

1. 实验六茶多糖的制备和红外光谱分析

2. 一、实验目的： 1. 学习分离多糖的原理和方法。 2. 掌握红外光谱法鉴定多糖的原理和方法。 二、原理： 利用多糖溶于水不溶于乙醇的性质，采用“水提醇沉淀”的方法，从茶叶粉的热水浸提液中提取多糖；再利用蛋白质在有机溶剂中变性沉淀的性质用“Sevag法”除去蛋白质，得到初步纯化的多糖。

3. 多糖是由单糖连接而成的多聚物。从上世纪70年代开始，人们发现多糖及复合物在生物体内不仅作为能量资源和构成材料，更重要的是多糖参与了细胞的各种活动，具有多种生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射等，而且对机体几乎没有毒副作用。多糖是由单糖连接而成的多聚物。从上世纪70年代开始，人们发现多糖及复合物在生物体内不仅作为能量资源和构成材料，更重要的是多糖参与了细胞的各种活动，具有多种生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射等，而且对机体几乎没有毒副作用。

4. 茶多糖 (tea-polysaccharide, TPS) 是茶叶中一类与蛋白质结合在一起的酸性多糖，具有降血糖、抗炎、抗凝血等药理作用，其中改善和治疗糖尿病是茶多糖最显著的功能。参与构成茶多糖的单糖有阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖和半乳糖等。

5. 多糖的提取方法： 1. 溶剂法：水提醇沉法、酸提法、碱提法、 超临界流体萃取法 2. 酶解法：单一酶解法、复合酶解法 3. 物理强化法：微波辅助法、超声波辅助法

6. 多糖的分离纯化： 1. 除蛋白：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法 2. 多糖的分离：分级沉淀法、色谱分离法 多糖的分析鉴定： 含量测定、纯度鉴定、分子量测定、结构测定等等

7. 多糖的红外光谱鉴定： 红外吸收光谱图中的吸收峰的数目及所对应的波数是由吸光物质分子结构所决定的，是分子结构的特性反映。 按吸收峰的来源，可以将中红外区波长为2.5um - 25um （波数为4000 - 400cm-1）的红外光谱图大体上分为特征频率区（4000- 1300cm -1）以及指纹区（1300-400cm-1）两个区域。

8. 特征频率区中的吸收峰主要是由基团的伸缩振动产生，有较强的特征性，在基团鉴定工作上有价值，主要用于鉴定官能团。如羰基 ( C=0) 的伸缩振动总是在1700cm-1左右，所以如果谱图中1700cm-1左右有一个强吸收峰，则大致可以断定分子中有羰基。此外，O-H的吸收峰在3650 - 3590cm-1，C-H的伸缩振动的吸收峰在2962 - 2853cm-1。

9. 指纹区的峰多而复杂，没有强的特征性，主要是由单键（C-O、C-N和C-X(卤素原子)）等的伸缩振动及C-H、O-H等含氢基团的弯曲振动以及C-C骨架振动产生。当分子结构稍有不同时，该区的吸收就有细微的差异。这种情况就像每个人都有不同的指纹一样，因而称为指纹区。指纹区对于区别结构类似的化合物很有帮助。指纹区的峰多而复杂，没有强的特征性，主要是由单键（C-O、C-N和C-X(卤素原子)）等的伸缩振动及C-H、O-H等含氢基团的弯曲振动以及C-C骨架振动产生。当分子结构稍有不同时，该区的吸收就有细微的差异。这种情况就像每个人都有不同的指纹一样，因而称为指纹区。指纹区对于区别结构类似的化合物很有帮助。

10. 茶多糖的红外光谱

11. 三、实验操作： 1. 主要仪器： 水浴锅、离心机、离心管、红外光谱仪、玛瑙研钵 2. 主要试剂： Saveg试剂（氯仿:正丁醇 = 4:1, v/v） 乙醇、丙酮、乙醚、KBr

12. 热水浸提 3. 实验步骤： • 1. 称取茶叶粉2g于250 mL烧杯→ 蒸馏水20 mL，保鲜膜覆盖→ 90℃水浴1h → 50 mL离心管，3000 rpm离心10 min； • 2. 量取上清液体积→ 加入3倍体积的无水乙醇→ 250mL离心管以4000 rpm离心20 min； • 3.沉淀转入50 mL离心管→ 10mL蒸馏水溶解（总体积约11-12 mL）→加入等体积Sevag试剂→剧烈手动振摇2 min，放气，3000 rpm 离心10 min； • 4. 小心转移上清液至100mL三角瓶→氨水调pH 8.0 → 80℃下加入等体积H2O2，保鲜膜覆盖，30min →加3倍体积的无水乙醇，置于250 mL离心管，4000 rpm离心20 min； • 5. 转移无色沉淀至10 mL 离心管→5mL无水乙醇充分捣匀→2000 rpm5min离心甩干→5mL丙酮、5mL乙醚依次洗涤，离心甩干→转移沉淀至培养皿内，玻棒压平冰箱保鲜吸潮干燥。 沉淀析出 除 蛋 白 漂 白 脱水干燥

13. 6. 红外光谱测定： 100 mg烘干的KBr粉末于玛瑙研钵中→ 加入1-2 mg干燥的多糖样品 →磨细混匀 →红外干燥灯下烘10 min →取约80 mg均匀填入压片机模具中，加压（当压力达到58.84 Mpa时保压约1 min） → 取出压好的透明薄片（直径为1 3 mm、厚度为0.1-0.2 mm），置于夹持器 → 将夹持器放入预热好的红外光谱仪的试样吸收池位置 → 起始透光率大于50%即可进行测量（400-4000 cm-1）范围内进行红外光谱扫描，记录扫描结果。

14. 注意事项： 1. 离心的两个配对的样品必须用托盘天平平衡重量； 2. 使用有机试剂时要注意通风； 3.KBr固体试样在研磨过程会吸水。水份的存在会产生光谱干扰。若有水分存在，试样压成片时易粘附在模具上不易取下，所以研磨后粉末应烘干一段时间。

15. 思考题： 1. 试比较多种提取多糖的方法各有何优缺点。 2. 多糖的分离方法有哪些？各是什么原理？