Microbiología de la leche y sus productos

1. Microbiología de la leche y sus productos Dr. Keiko Shirai

2. La leche es una mezcla de sustancias definidas en las que se distinguen tres estados: • emulsión de materia grasa bajo forma globular • suspensión de la caseína, ligada a sales minerales • solución o fase hídrica que forma el medio general continuo Composición Agua 87% Lactosa 4.9% Lípidos 3.7% Proteínas 3.5% Minerales 0.7% Todas las vitaminas Aw > 0.98 pH 6.6

3. La leche constituye un buen medio de cultivo para los organismos heterotrofos aptos para asimilar lactosa (única fuente de energía) y proteínas (al no haber aminoácidos libres resulta una limitación para crecimiento). Sodium caseinateA protein-based additive extracted from milk and used to stabilize the fat in an emulsion.Scale=50 µ, Size=110 KB (SEM http://sci.agr.ca/crda/indust/microscope_e.htm)

4. Fuentes de contaminación 1.- Infección inicial 2.- Ambiente 3.- El estado del animal 4.-El estado del ordeñador 5.- Utensilios y máquinas 6.- Calidad del agua

11. Principales grupos de microorganismos que se encuentran en la leche Lácticas Micrococos Gram positivas   Estafilococos • BacteriasEsporuladosDiversas Enterobacterias Gram negativas  AcromobacteriasDiversas Micobacterias • Levaduras • Hongos

13. Micrococos • Bacterias esféricas dispuestas en agrupaciones irregulares en racimos, en tétradas o paquetes. • La mayoría de las especies que abundan en los alimentos son aerobias, no patógenas (desprovistas de coagulasa y hemolisina) y catalasa positivas. • Es flora inocua, es frecuente después del ordeño por su temperatura óptima elevada (25° a 30°C). • La importancia de los diferentes micrococos en alimentos: • Algunas especies son capaces de utilizar las sales de amonio otros compuestos nitrogenados sencillos como única fuente de nitrógeno, • la mayoría de las especies son capaces de fermentar azúcares produciendo una mediana cantidad de ácido, • algunas desdoblan las proteínas con producción de ácidos (M freudenreichii), • otras toleran concentraciones elevadas de sal, son capaces de crecer en medios con valores de humedad relativamente bajos; estas especies crecen en las salmueras, • algunas son termodúricas, resisten al tratamiento de comercial que se aplica a la leche (M. varians), • otras producen pigmentaciones y coloraciones anormales en la superficie de los alimentos, por ejemplo M. luteus produce un pigmento amarillo, mientras que M. roseus produce un pigmento rosado, • algunos micrococos son capaces de crecer a temperaturas próximas o inferiores a los 10°C. • Los micrococos abundan en polvo y agua, se encuentran frecuentemente en los utensilios y equipos insuficientemente lavados y desinfectados

16. Gram positivas diversas Corynebacterium • Son bacilos finos con temperatura óptima elevada (37°C). Es comensal de la ubre de vaca, se puede encontrar en leche ordeñada y puede producir mastitis bovina ( C. bovis). El microorganismo de la difteria, C. diphteriae puede ser vehiculado por alimentos. Corynebacterium diphteriae.

17. Gram positivas diversas… Bacterias propiónicas • Son bacilos pequeños, inmóviles, esporógenos, catalasa positivos, anaerobios o aerotolerantes; cuya forma suele ser cocoide y a veces se presentan en cadenas. Fermentan ácido láctico, carbohidratos y los polialcoholes produciendo ácido propiónico, acético y dióxido de carbono. • En el queso suizo, ciertas especies (por ej. Propionibacterium freudenreichii) fermentan los lactatos para producir gas que favorece la formación de las cavidades, hoyos, contribuyendo al sabor. Las propionibacterias productoras de pigmentos pueden producir coloraciones anormales en el queso.

18. Gram positivas diversas Brevibacterium • Son bastoncitos cortos (cocoides). No fermentan lactosa. Brevibacterium linens puede tener importancia en la producción de manchas en la superficie de determinados quesos, por ejemplo queso de barra o de Limburger en el que el crecimiento de esta especie produce una coloración rojo-anaranjada y contribuye a madurarlo. Brevibacterium linens

19. Enterobacterias • Las más frecuentes son las que fermentan lactosa. Son huéspedes normales del intestino de mamíferos se atribuye a contaminación fecal. Se pueden desarrollar a diferentes temperaturas. Importancia: • Higiénico. Algunas especies ocasionan enfermedades gastrointestinales • Tecnológico. Compiten con bacterias lácticas para fermentar lactosa

20. Enterobacterias Escherichia • Se encuentra en las heces, es un bacilo aislado del tubo intestinal de los animales de sangre caliente y que se encuentra muy difundido en la naturaleza. Algunos son patógenos potenciales para el hombre. • E. coli es único productor de indol del grupo, produce gas y ácidos orgánicos (láctico, acético, succínico) es menos acidificante que las bacterias lácticas pH menor de 5 a 5.2, de hecho son inhibidas a bajo pH.

21. Acromobacterias • Son aerobias, saprófitas, actividad enzimática limitada,. Parte esencial de la microflora psicrófila que prolifera en la leche conservada a bajas temperaturas. Producen sustancias viscosas ó coloreadas. Se distinguen los siguientes géneros: • Alcaligenes Como indica su nombre prefiere medios de pH básico. A. viscolactis produce viscosidad en la leche y A. metalcaligenes produce un crecimiento mucoso en la superficie del requesón. Estos microorganismos proceden del estiércol, piensos, suelo, agua y polvo. Este género también incluye a microorganismos que anteriormente eran clasificados como Achromobacter. • Flavobacterium Las especies de este género producen pigmentos de color variable del amarillo al naranja, pueden producir coloraciones anormales. Algunas especies son psicrótrofas.

22. Gram negativas diversas Pseudomonas • Estas bacterias son bácilos gramnegativos, generalmente inmóviles. Transportadas principalmente por aguas no potables. Forman parte de la microflora psicrófila. Se desarrollan a Aw altas (0.97 a 0.98), el calor las destruye con facilidad, su crecimiento es escaso si no disponen de oxígeno, resistentes a la desecación, y su crecimiento es escaso o no crecen a temperaturas superiores a los 43ºC. Poseen propiedades que las hacen de importancia en alimentos: • Por su capacidad para utilizar compuestos de carbono que no sean carbohidratos; • por producir diversas sustancias que influyen desfavorablemente en el sabor; • su capacidad para utilizar alimentos nitrogenados sencillos; • su capacidad para sintetizar sus propios factores de crecimiento o vitaminas; • la actividad proteolítica y lipolítica de algunas especies; • su tendencia aerobia que les permite un crecimiento rápido y producir productos de oxidación y mucosidad en las superficies de los alimentos; • su capacidad para crecer a temperaturas bajas; • producción de pigmentos por ejemplo Pseudomonas fluorescens (fluorescencia verdosa) y P. nigrifaciens (color negro); • su resistencia a algunos desinfectantes y detergentes. Pseudomonas fluorescens

23. Gram negativas diversas • Brucella Bacterias patógenas causales de la brucelosis (B. abortus). The infection in humans begins with flu-like symptoms. If not treated it may develop into undulant (recurring) fevers, arthritis, and in males infection of the reproductive tract.

24. Gram negativas diversas • Micobacterias Bacilo causante de la tuberculosis vehiculado por leche cruda presenta un aspecto filamentoso y afinidades con hongos. Mycobacterium tuberculosis Cycle of Mycobacterium bovis transmission between cattle and humans. The thickness of the arrows suggests probability.

27. Modificaciones en leche debido a microorganismos

28. Lactosa La lactosa es el principal compuesto energético; hay producción de ácidos orgánicos, con frecuencia se observa coagulación en la leche.

29. Productos de fermentación obtenidos a partir de lactosa por diversos grupos microbianos.

30. Proteínas Se descomponen tras coagulación enzimática, con formación de sustancias fijas y gases. Es más rápida en medio neutro o alcalino, aunque puede producirse en medio ácido.

31. Materias grasas Son hidrolizadas por lipasas microbianas

32. Acidificación • A temperatura media (15-35°C), la fermentación ácida de la lactosa es la alteración más rápida que se manifiesta en todos los productos lácteos (leche, crema, queso fresco, lactosuero). Las bacterias lácticas son la microflora más acidificante aunque E. coli produce más ácido láctico que las bacterias lácticas heterofermentativas. • Algunos microorganismos esporulados del género Bacillus coagulan la leche con baja acidificación por acción de una proteasa posteriormente degradan la lactosa y entoncés producen una mezcla de ácidos.Ejemplos: Bacillus coagulans con una temperatura óptima de 45°C, importante en leches concentradas es aerobio, facultativo y puede desarrollarse con muy poco oxígeno en botes mal esterilizados deteriorandolos.Bacillis calidolactis (B. lactis acidophillus)se encuentra en leches pasteurizadas, termófilo con temperatura óptima de 60°C no se desarrollan por debajo de los 40°C.

33. Coagulación sin acidificación y proteólisis • La descomposición proteolítica va precedida de una coagulación por bacterias que producen enzimas parecidas a la quimiotripsina. La coagulación tiene lugar en medio neutro o ligeramente ácido, temperaturas bajas de 10 a 15°C la favorecen.Ejemplos: • Bacillus se presenta en productos calentados leches y cremas pasteurizadas. Son proteolíticos y poseen lectinasas que disgregan glóbulos grasos (defecto de crema cortada) (B. cereus y B. subtilis). • Bacterias no esporuladas coagulación incompleta la más importante es la proteólisis Proteus, Pseudomonas, Serratia.Cocos. Streptococcus liquefaciens coagula la leche antés de la acidificación. Bacillus cereus

34. Fermentaciones gaseosas • Levaduras de la lactosa. Soporta acidez elevada con temperaturas óptimas por encima de 30°C, producen poco alcohol. Son más activas en crema y quesos frescos, producen CO2 y olor característico a levadura. • Bacterias coliformes. El gas producido no es CO2  puro sino mezclas con H2. Muy indeseables producen olores desagradables y en ocasiones sustancias viscosas. • Clostridios. Se desarrollan en la leche cuando las bacterias acidificantes se han destruido por calentamiento y el medio se encuentra exento de aire. Produce CO2 e H2  y algunas veces CH4. De gran importancia en leche esterilizada, evaporada, quesos fundidos, de pasta cocida (gruyere).

35. Fermentaciones viscosas • Existen microorganismos que al desarrollarse aumentan la viscosidad, debido a producción de gomas (polisacáridos, galactanos) y mucinas (sustancias glúcido-nitrogenadas). Es perjudicial en leches de consumo, por otra parte el aumento en viscosidad se busca para productos como yogurt y cremas. Los microorganismos causales son inofensivos, se eliminan con la pasteurización. • Producción de viscosidad en medio neutro o poco ácido común en leches crudas, m.o. causantes: • Alcalígenes viscosus aerobio con temperaturas óptimas de 10 a 37°C. • Aerobacter aerogenes y Staphilococcus cremoris viscosi • Producción de viscosidad en medio ácido común en leches crudas, m.o. causantes: • Asociada a la fermentación lactica: Streptococcus lactis var hollandicus, Lactobacillus casei y Lb. bulgaricus.

36. Producción de olores y sabores • Rancidez. Producida por lipasas alteran cremas, leche y mantequillas.Pseudomonas (P. fluorescens, P. fragi) y Achromobacter (A. lipolyticum), son también proteolíticas. En la leche y crema la rancidez debida a estas bacterias que se producen a temperaturas bajas (5 a 10°C). Muchos hongos producen lipasas. • Sabores Diversos A malta o cocido, Amargos, A papa, A sucio, Frutales, Butíricos

37. Producción de color • Pseudomonas cyanogenes AzulPseudomonas synxatha AmarilloSerratia marcescens      RojoTorula glutinis              RosaLevaduras                       Rosa, Rojo y MarrónHongos                            Manchas de apariencia seca y colores diversos.

38. Calidad microbiológica de la leche

39. Directos Métodos para determinar la calidad microbiológica • Microflora total por cultivo • Recuento directo al microscopio • Investigación de determinación de grupos microbianos • Microorganismos termorresistentes Indirectos

40. Microflora total por cultivo • Las muestras de la leche se diluyen decimalmente y se inoculan en placas que contienen medio de cultivo como agar de cuenta estándar o triptona, se incuba de 2 a 3 días a 30°C y se cuentan colonias.

41. Recuento directo al microscopio Método de BreedSe extiende de 0.01 a 0.05 ml de leche sobre un portaobjetos en un espacio de 1 a 4 cm2; se seca, se desengrasa con xilol, se fija con alcohol y se tiñe con azul de metileno al 0.3%.

42. Investigación de determinación de grupos microbianos Bacterias coliformesSe utilizan medios selectivos que contienen sales biliares: caldo verde brillante, agar desoxicolato. Otra técnica es la de "bacto-strip", consiste en tiras de papel impregnadas con medios de cultivo selectivo y un indicador. Las tiras se empapan con la leche y se incuban a 37°C.

43. Microorganismos termo resistentes La muestra se mantiene a 63°C durante 30 minutos y se efectúa la siembra sobre medios de cultivo, se incuba y se cuentan colonias. Bacterias esporuladas anaerobias, productoras de gas.La leche se calienta a 85°C durante 10 minutos en un tubo de ensayo con un trozo de parafina; sobreviviendo las esporas. Tras enfriamiento la parafina se solidifica en la superficie. Se incuba a 37°C se detecta la presencia de bacterias esporuladas por la producción de gas que levanta el tapón de parafina.

44. Acidez y pH

45. Prueba del alcohol • Se mezclan partes iguales de leche y etanol 68° GL. El resultado será positivo cuando se aprecia floculación, o negativo en ausencia de esta.Existe una buena correspondencia entre esta prueba y la estabilidad de la suspensión coloidal que depende de la acidificación de la leche o bien por un alto contenido de calcio.

46. Prueba de ebullición • La leche se calienta en baño maría durante 5 minutos, se observa coagulación (resultado positivo) o ausencia de esta (resultado negativo).

47. Lactofermentación • La leche se incuba de 30 a 37°C en un tubo estéril, durante 12 a 24 horas. La leche es de buena calidad sino coagula antés de 12 horas. El aspecto del cóagulo después de 24 horas permite deducir la actividad microbiana. Si es homogéneo y gelatinoso indica fermentación homolactica; si es esponjoso con burbujas de gas indica posible presencia de coliformes.

48. Prueba de la filtración

49. Pasteurización • Definición • Condiciones de Pasteurización • Temperatura • Tiempo • Objetivos de la Pasteurización • Microorganismos que resisten la Pasteurización

50. Tipos de Pasteurización BajaAltaRelámpago