Přenos jader

1. Přenos částí buněk Přenos jader Ne příliš úspěšné, přesto popsány intra- a interdruhové přenosy 1985získány důkazy o funkci genů přeneseného jádra Přenos mikrojaderjádra obsahující jen část jaderného materiálu Získání: synchronizovaná kultura + mitotický jed, který ovlivňuje funkci vřeténka --- neorganizovaný přechod chromozomů do dceřiných buněk – část obsahuje jen např. 1-2 chromozomy Přenos chromozomů Izolace chromozomů - po synchronizaci - nejlépe v metafázi Přímá vazba na protoplasty pomocí fuzogenů (PEG – nízká frekvence přenosu) Mikroinjekce – vyšší frekvence – lepší regenerace při mikroinjekci do celistvých buněk ?? Osud přeneseného chromozomu, doba trvání v cytoplazmě, fáze buněčného cyklu recipientní buňky Přenos chloroplastů 1969 - přenos špenátových chloroplastů do živočišných buněk 1971 – přenos do slepičích vajíček - přežívání, metabolická aktivita, dělení 1973 – komplementace protoplastů – fúze zelených protoplastů a mutantních s nevyvinutými plastidy – zelenání deficientních chloroplastů Přenos mitochondrií přímá vazba nebyla popsána přenos pomocí fúze protoplastů cytoplazmatičtí hybridi - znuvuuspořádání mt DNA – rekombinace

2. Přenos izolované DNA (direct gene transfer) 1977 mnoho pokusů, chyběl důkaz integrace do recipientního chromozomu Nevýhoda : vyšší frekvence přeorganizování transgenu a vyšší počet kopií Množství způsobů přenosu DNA: • Přenos pomocí působení PEG • Elektroporací • Mikroinjekcí • Mikrobombardováním

3. Přenos pomocí působení PEG Chemický „helper“ • PEG, Ca 2+ zvyšuje vazbu DNA na povrch protoplastu • Poly L- ornitin – zpomaluje degradaci plazmidové DNA DNázami, stimuluje vazbu (neutralizací povrchového náboje) a expresi DNA v protoplastech • Krystalky fosforečnanu vápenatého- + fuzogen +  pH – endocytóza krystalků Lipozomy- fosfolipidy dispergované ve vodní fázi, podle podmínek a typu fosfolipidu různé uspořádání i náboj. Chrání DNA, nejlepší fosfatidylserin • Elektroporace 250-350 V, ms, 2000 V, µs – narušení buněčné membrány, vytvoření pórů umožňujících vstup DNA do buňky (narušení membrány laserem) - buňky, pletiva, SE

4. DNA • Mikroinjekce Imobilizace buněk: skelný povrch pokrytý polylyzinem, přidržovací pipeta • lépe mikroinjekce do jádra (karyoplasty) –  degradace • Koncentrace DNA -  vyšší koncentrace  zvýšení frekvence transformace, ale pozor !! koncentrace toxické • Forma DNA – lineární x nadšrobovicové (supercoil): lineární – vyšší frekvence transformace • DNA lze přenášet mikroinjekcí i do mikrospor, celých buněk, semen  lepší přežívání a regenerace

5. Co ovlivňuje výsledek ? • Frekvence přežití buněk po transformačním působení • Frekvence rekombinace + frekvence exprese • Frekvence regenerace buněk za daných podmínek • Biolistická metoda (particle gun, particle bombardment) (1987) • ostřelování rostlinné buňky projektily: DNA navázaná na inertní kov (wolfram, zlato)

6. Řešení otázek : • Mechanismu infekce • Vliv na expresi jaderných genů • Interakce mezi různými viry • Rezistence k virům Vektorový přenos DNA • virové vektory • systém Agrobacteria Virové vektory Lze použít k přenosu cizorodé DNA, neintegrující Dochází k rozšíření, zmnožení a expresi vloženého genu. Kromě patogenicity (např. nahrazení genu pro plášťový protein genem X) rekombinantní virus napodobuje svůj přirozený protějšek v ostatních aspektech možnost koexistence mnohočetných genů, je-li zachována schopnost autonomní replikace

7. Systém Agrobacteria Agrobacterium běžná půdní bakterie Dvouděložné po poranění a infekci – proliferační schopnost --- tvorba dediferencovaného tumorového pletiva nebo modifikovaných kořenů • Agrobacterium tumefaciens – cown gall- halka • Agrobacterium rhizogenes - hairy roots Čeleď Rhizobiaceae – všichni příslušníci ovlivňují morfologii rostlin, ale jen Agrobacterium mění genetickou výbavu rostlinných buněk Izolace tumorových pletiv a přenesení do podmínek in vitro • růst na médiu bez růstových regulátorů • produkce nových látek – opinů a agropinů

8. 1974objeven plazmid, prokázána souvislost s virulencí • 1977 důkaz vnášení části genetické informace plazmidu do • rostlinného genomu. Dělení podle produkovaných látek na jednotlivé typy:  oktopinový  nopalinový  manopinový  agropinový  agrocinopinový  leucopinový Opiny - deriváty aminokyselin -- zdroj C a N pro bakterie -- konjugace mezi bakteriemi Agropiny - deriváty cukrů -- zdroj C pro bakterie (stabilní, rostlinou nemetabolizovatelné) nejprostudovanější: oktopinový a nopalinový typ (deriváty argininu)

9. Agrobacterium tumefaciens Ti plazmid (150-200kb) T-DNA-oblast ohraničená specifickými sekvencemi, přenášená do jádra rostlinné buňky Vir oblast Replikační počátek Konjugativní přenos Katabolizmus opinů T-DNA nopalinový typ T- DNA 1 segment (23kb) oktopinový typ T-DNA 2 segmenty (13,6; 7kb) • T-DNA – nopalinový typ : • geny kontrolující syntézu auxinů • -“- cytokininů • geny ovlivňující rychlost růstu tumorů • geny pro syntézu nopalinů • geny pro syntézu nosičových proteinů T-DNA – oktopinový typ TR - syntéza oktopinů TL - tumorový růst Z infikovaných buněk nelze regenerovat rostlinu

10. Vir-oblast Funkce nutné pro vystřižení, přenos a integraci T- DNA (vir oblast nopalinového a oktopinového typu mohou komplementovat) Vir-oblastnení přenášena,zahrnuje několik operonů (vir A (1 protein); vir B (11); vir C (2); vir D (4) vir E (2) Vir G (1), (u některých kmenů vir F, vir H, vir J) Ti plazmid Syntéza a transport extracelulárních polysacharidů Vir oblast Psc A E Chv A Chv B D A G C B konstitutivně Fenolická látka Agrobacteriumtumefaciens připojené k rostlinné buňce Poraněná rostlinná buňka

11. Sled dějů při přenosu T-DNA do rostlinné buňky • Rozpoznání přítomnosti poraněné rostliny, signál: fenolické látky  chemotaxe • Připoutání bakteriální buňky k rostlinné b. - produkty chromozomálních genů (chvB tvorba -1,2 glukanu; chvA– transportní protein – doprava do periplazmatického prostoru, pscA produkce sukcinoglykanu • Vazba signálních molekul na receptorové proteiny (vir A)  změna konformace proteinu vir A aktivace vir G • Produkt genu vir G aktivace genů vir oblasti • Vytvoření zlomu pro uvolnění T-DNA , vir D1,vir D2odvíjení jednovláknové T-DNA vir D1, vir D2, Vir C1 • Vytvoření přenosového komplexu Vir D2 Vir E2 • Přenos komplexu přes bakteriální a rostlinné stěny (geny vir B) • Vnesení T-DNA do buněčného jádra vir D2 , vir E2 • Integrace do jaderné DNA, přenos do náhodných míst rostlinného genomu

12. Agrobacterium rhizogenes Homologie Ti a Ri plazmidů choroba – „hairy roots“--- zodpovědný Ri plazmid (root inducing) manopinový typ T DNA … jeden segment T-DNA agropinový typ T-DNA …. dva segmenty T-DNA Téměř všechny kmeny A . rhizogenes mají 3 komponenty plazmidu Ri. malý plazmid: geny pro utilizaci opinů; střední plazmid: T-DNA a jiné geny pro utilizaci opinů velký plazmid: kointegrát obou předchozích T-DNA : geny pro syntézu auxinu, + rolB a rol C – interferující s metabolizmem r. hormonů   citlivost k endogenním auxinům. Vnesené geny jsou nejaktivnější v dediferencovaných pletivech, z „hairy roots“ tumorů lze regenerovat rostliny, které jsou ovšem abnormální

13. T- DNA vnášený gen T- DNA hraniční sekvence T- DNA vnášený gen hraniční sekvence T- DNA binární vektor Ti plazmid zbavený T-DNA klonovací plazmid: replikační počátek T-DNA hraniční sekvence přenášený gen selektovatelný marker Vektorový přenos při transgenozi a) onkogenní b) neonkogenní a) omezené využití, produkce tumorového pletiva u infekce Ti plazmidovou T-DNA nelze regenerovat dospělé rostliny b) nevytváří se tumor – možná regenerace rostliny

14. Transformační systém • Společná kultivace protoplastů s Agrobacteriem • Infekce listových diskůAgrobacteriem • Infekce rány na rostlině in vivoAgrobacteriem • Ponoření vyvíjejících se květů do bakteriální kultury – selekce semen Přenesení vytvořeného kalusu na médium  odstranění Agrobacteria antibiotikem  růst tkáňové kultury  regenerace Přenos a exprese cizorodé DNA Možný přenos  jakékoli DNA (přeneseny až segmenty o 50kb) ?? Exprese genů - zachování regulátorových sekvencí genů; nutné iniciační a terminační sekvence funkční v rostlinné buňce Nevýhoda: nehodí se pro všechny rostliny a všechna pletiva (přednostně funguje u dvouděložných), jednoděložné výběr vhodného kmene, supervirulentní kmeny s více kopiemi některých Vir genů. Možnost vytvoření stabilních mutantů – využití ke šlechtění rostlin • Stabilita genů T-DNA: • přenosné přes meiosi • exprese genů se postupně snižuje - specifická vlastnost, která se projevuje jen při zachování • T- DNA ( X transgenoze) • zjištěna závislost mezi metylací a potlačením exprese

15. Budoucnost a rizika ? Biotechnologie a životní prostředí • Využití technik biotechnologie rostlin • pro rozvoj znalostí fyziologie rostlin • k praktickému využití • Množení rostlin Komerčně významné rostliny ? Genetická uniformita Ohrožené rostliny • Ozdravování rostlin ? Somaklonální variabilita • Produkce sekundárních metabolitů, biotransformace • Mutageneze in vitro ? Genetická uniformita ? Somaklonální variabilita

16. ? Biotechnologie a životní prostředí ? Transgenní rostliny a životní prostředí Je snaha vnášet znaky související s • rezistencí k chorobám (k virům (pouzdrové proteiny); bakteriím; houbám) • 2. rezistencí k parazitům (geny pro toxiny působící na škůdce, Bacillus thuringiensis) • 3. rezistencí k herbicidům (modifikovaný cílový protein; nadprodukce cílového proteinu; detoxifikace herbicidu) • 4. rezistencí k chladu, osmotickému stresu etc. (změny v obsahu osmoticky aktivních látek, stresových proteinů…) • 5. zlepšením kvality produktů (změny v zastoupení a obsahu zásobních látek) • 6. produkcí látek (farmaka, protilátky, vakcíny, technické látky, „molecular farming“)

17. Rizika využívání transgenních rostlin Nebezpečí 1:transgenní rostlina se stává nekontrolovatelným plevelem (díky ovlivnění schopnosti přežití) GMOin USA typy rostlin : na lidech závislé lidmi dobře kontrolovatelné na lidech nezávislé Nebezpečí 2:přenos genu na divoké příbuzné rostliny možnost křížení překryv kvetení výskyt divokých příbuzných v dané lokalitě Nebezpečí 3:přenos genu na nepříbuzné rostliny (? viry, Agrobacterium) Nebezpečí 4:zvýšení používání herbicidů

18. Nebezpečí 5:hromadění látek v rostlinách, které mohou být toxické pro lidi nebo zvířata (herbicidy, toxiny, nové látky) Nebezpečí 6:ovlivnění metabolizmu transgenní rostliny nežádoucím směrem Nebezpečí 7:porušení rovnováhy - vliv na divokou faunu, floru ! Hodnocení každého jednotlivého případu zvlášť ! Nutnost • pečlivého výběru genu i recipientní rostliny • testování transgenních rostlin v uzavřených prostorách (skleníky) • sledování v polních pokusech za přísných bezpečnostních opatření

19. Nebezpečí 5:hromadění látek v rostlinách, které mohou být toxické pro lidi nebo zvířata (herbicidy, toxiny, nové látky) Nebezpečí 6:ovlivnění metabolizmu transgenní rostliny nežádoucím směrem Nebezpečí 7:porušení rovnováhy - vliv na divokou faunu, floru ! Hodnocení každého jednotlivého případu zvlášť ! Nutnost • pečlivého výběru genu i recipientní rostliny • testování transgenních rostlin v uzavřených prostorách (skleníky) • sledování v polních pokusech za přísných bezpečnostních opatření

20. Díky za pozornost