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生物化學實驗單元

生物化學實驗單元. 生物工程系. 醣類鑑定 Molish 反應 ( 醣類 ) Seliwanoff 反應 ( 酫酮醣 ) Barfoed 反應 ( 單雙多醣 ) Schiff (Aniline Acetate) 反應   TLC 分離. 胺基酸鑑定 Ninhydrin 反應 Lead Acetate ( 醋酸鉛 ) 反應 Ehrlich 重氮反應 Millon 反應 TLC 分離. 酵素活性檢測

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生物化學實驗單元

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Presentation Transcript

  1. 生物化學實驗單元 生物工程系 • 醣類鑑定 • Molish反應 (醣類) • Seliwanoff反應(酫酮醣) • Barfoed反應(單雙多醣) • Schiff (Aniline Acetate)反應   • TLC分離 • 胺基酸鑑定 • Ninhydrin反應 • Lead Acetate (醋酸鉛)反應 • Ehrlich重氮反應 • Millon反應 • TLC分離 酵素活性檢測 澱粉酶(amylase)可將澱粉水解產生還原糖，而還原糖量的多寡，可利用DNS試劑測定。由於還原糖可將DNS還原成3-amino-5-nitrosalicylic acid，且後者會吸收540 nm波長的光，吸光值與濃度成正比，故可藉由偵測540 nm的吸光值變化，間接檢測澱粉酶催化產生還原糖的速率，亦即酵素活性。 蛋白質定量與電泳分析 以Lowry與Bradford法進行蛋白質定量實驗。另外，利用Native PAGE與SDS PAGE進行蛋白質電泳分離與分析，並鑑定個別蛋白質之分子量。 總脂質/總膽固醇測定 脂質之測定法有很多種，磷酸香草素反應法，是最簡便、快速且正確地作比色測定，其原理為檢樣中之脂質於濃硫酸中加熱，經磷酸香草素之作用，產生粉紅色的發色染料。 膽固醇的測定，以冰醋酸及醋酸酐為溶媒及脫水劑，濃硫酸為脫水劑及氧化劑，金屬離子(Fe2+，Al3+，Co2+) 為催化劑，或加熱至80~95C來催化反應。 質體DNA萃取/PCR/核酸電泳分析 本實驗以Geneaid質體抽取套組(鹼性裂解法)，從E. coli抽取含有β-glucosidase II基因之質體pBARGEM7-2，再使用PCR方法放大目標基因片段，並以瓊膠(agarose gel)電泳來作確認，其目的在使學生熟悉重組基因操作之基本技術。

  2. 生化實驗 生物工程系 胺基酸鑑定 本實驗在利用簡單的化學反應區分胺基酸之結構特性，首先採用Ninhydrin反應將胺基酸與其他生物大分子區別。而Lead Acetate (醋酸鉛)反應、Ehrlich重氮反應、Millon反應則可針對三種特定胺基酸結構特性(Cysteine、Tryptophan與Tyrosine)於呈色型態之化學性質加以鑑定。最後再以薄層層析法有機親和力大小差異應用在胺基酸分子之分離。此外亦提供未知溶液與同學自行利用上述方法 。 實驗內容 1. Ninhydrin反應 2. Lead Acetate (醋酸鉛)反應 3. Ehrlich重氮反應 4. Millon反應 5. TLC分離 實驗步驟

  3. 生化實驗 生物工程系 醣類鑑定 本週實驗在利用簡單的化學反應區分醣類之結構特性，首先採用Molish試驗將醣類與其他生物大分子區別。而Seliwanoff反應(酫酮醣)、Barfoed反應(單雙多醣)、Schiff (Aniline Acetate)反應 (5C、6C)則可針對各種結構特性於呈色型態、時間快慢等物理或化學性質加以鑑定。最後再以薄層層析法有機親和力大小差異應用在醣類分子之分離。此外本週提供未知溶液與同學自行利用上述方法組合設計出醣類分有效鑑定之流程，以達成 生化分子結構之認知學習。 實驗內容 1.Molish反應 (醣類) 2.Seliwanoff反應(酫酮醣) 3.Barfoed反應(單雙多醣) 4.Schiff (Aniline Acetate)反應 (5C、6C) 5 TLC分離 實驗步驟

  4. 生物工程系 生物化學實驗 蛋白質定量與電泳分析 • 本實驗將以Lowry與Bradford法進行蛋白質定量實驗。另外，利用native PAGE與SDS PAGE進行蛋白質電泳分離與分析，並鑑定個別蛋白質之分子量。 Lowry Method Bradford Method OD640 nm OD595 nm 製作膠片 電泳 • 計算Rf值 • 求各蛋白質分子量 染色、褪染

  5. 1. 酵素反應速率測定 0、5、10、15分鐘 2.不同酵素濃度 20、40、80 l 3. 酵素最適反應pH pH 4、pH 7、pH 10 4.酵素最適反應溫度 20、37、50、70C 5. 抑制劑對活性的影響 PMSF 6.不同基質濃度 5、10、15、20、30 l 50mM (BAPA) 求 Vmax、Km Lineweaver-Burk plot Eadie-Hofstee plot V0 = -Km Hanes plot 生物工程系 生物化學實驗 酵素動力學分析 • 本實驗將測定胰蛋白酶的反應速率及反應速率常數，同時將分析酵素濃度、基質濃度、pH值、溫度及添加抑制劑對酵素活性之影響。

  6. 生物化學實驗 生物工程系 總脂質/總膽固醇測定 脂質之測定法有很多種，磷酸香草素反應法，是最簡便、快速且正確地作比色測定，其原理為檢樣中之脂質於濃硫酸中加熱，經磷酸香草素之作用，產生粉紅色的發色染料。 膽固醇的測定，以冰醋酸及醋酸酐為溶媒及脫水劑，濃硫酸為脫水劑及氧化劑，金屬離子(Fe2+，Al3+，Co2+) 為催化劑，或加熱至80-95C來催化反應。 總脂質測定 總膽固醇測定 膽固醇未知液 + Isopropanol稀釋 前處理： 脂質未知液 + 濃硫酸 加醋酸 Parafilm 封口沸水加熱後冷卻 加三氯化鐵 呈色反應： 未知處理液 + 磷酸香草素呈色試劑 加硫酸 溫和轉動混勻 靜置30分鍾 靜置10~15分鐘 OD530測定吸光值 OD560測定吸光值 計算總脂質 計算總膽固醇

  7. 生物工程系 生物化學實驗 質體DNA萃取/PCR/核酸電泳分析 本實驗以Geneaid質體抽取套組(鹼性裂解法)，從E. coli抽取含有beta-glucosidase II基因之質體pBARGEM7-2，再使用PCR方法放大目標基因片段，並以瓊膠(agarose gel)電泳來作確認，其目的在使學生熟悉重組基因操作之基本技術。 使用Geneaid 的High-Speed Plasmid Min Kit抽取質體 PCR放大目標片段 電泳分析

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