אינטראקציות בין חלבונים Protein – protein interactions

1. אינטראקציות בין חלבוניםProtein – protein interactions מנחה פרופ'מיכל ליניאל מגיש אלעד מזומן

2. אבל למה?!? • הבנה מלאה של תהליכים ביולוגיים. • קומפלקסים חלבוניים. • מסלולים תאיים. • הכרת החלבונים בלבד איננה מספיקה. • העלאת השערות לגבי תפקידי חלבונים לא ידועים.

3. מה נשתנה? • שיטות לגילוי קשרים קיימות מזה זמן רב – לדוגמא - Immunoprecipitation. • פתירת גנומים שונים  גילוי חלבונים חדשים בקצב מהיר. • דרושות שיטות high throughput. • צורך לשלב שיטות גנומיות, ביוכימיות וביופיזקליות

4. התוכנית להיום • הכרת שיטות למיפוי אינטראקציות. • השוואה בניהן. • הצגה של מחקר מקיף על אינטראקציות בשמר. • הצגה של מחקר פחות מקיף על אינטראקציות באדם.

5. הצגת השיטות מבוסס על המאמרים: • Legrain P et al. (2001) Protein--protein interaction maps: a lead towards cellular functions, Trends Genet;17(6):346-52. • von Mering C. et al.(2002) Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417(6887):399-403

6. Yeast 2 Hybrid Assay Hybrid proteins Fishing for proteins that interact with bait domain Lodish 5th 11-39

7. Transcriptional activation by hybrid proteins in yeast Lodish 5th 11-39

8. Lodish 5th 11-39

9. Matrix approach sticky Auto activator Legrain P et al. (2001) Protein--protein interaction maps: a lead towards cellular functions, Trends Genet

10. Matrix approach • רק חלבונים מוכרים נבדקים. • הבדלים משמעותיים בין שני מחקרים שנעשו – 841 מול 692 ורק 141 חופפים. • Sticky preys • Auto activators • Pools לעומת array

11. Screening of fragment libraries Legrain P et al. (2001) Protein--protein interaction maps: a lead towards cellular functions, Trends Genet

12. Screening of fragment libraries • אין צורך בחלבונים מוכרים. • מציאת ה interacting domain. • עלות גבוה – הכנה דורשת הרבה משאבים.

13. טעויות בתוצאות • False negative • הגברת טעויות ב PCR ( 13%לא שובטו כמו שצריך). • 90% מהאינטראקציות הידועות פוספסו. • ב pools ישנן פחות תוצאות משיטת ה array • False positives • קשרים שאין להם משמעות ביולוגית. • Sticky, auto activators.

15. Y2H • In vivo • מאתרת "קשרים שבירים" – עדינה. • לא מוטת לטובת חלבונים נפוצים. • ה fusion protein עשוי להפריע לאינטראקציה. • רק 2 חלבונים נבדקים באותו זמן – אין בדיקה של אינטראקציה שיתופית. • מתרחשת בגרעין. • לא בודקת תנאים פזיולוגים.

16. Epitope Tagging ANALYSIS OF PROTEINS AND PROTEOMES BY MASS SPECTROMETRY Matthias Mann et al Annu. Rev. Biochem. 2001.

17. Epitope Tagging + MS (Mass Spectrometry) • Internal check for consistency. • קומפלקסים אמיתיים בתנאים פיזיולוגים. • מגלה רק קומפלקסים שמתארגנים בתנאים הנבדקים. • הסימון יכול להפריע. • בזמן השטיפה יתכן ונאבד חלבונים.

18. MS vs. Y2H

19. TAP - Tandem Affinity Purification A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration Guillaume Rigaut et al 1999 Nature America

20. HMS-PC High-Throughput Mass-Spectrometric Protein Complex Identification • ביטוי יתר של החלבון - inducible overexpression

21. Correlated mRNA expression(Synexpression) • בדיקת ביטוי mRNA קיבוץ (clustering) גנים ע"פ הביטוי. • מהירה ונוחה. • מכסה הרבה מצבים פיזיולוגים. • רק רומזת על אפשרות לקשרים. • תלויה מאוד בקריטריונים לקיבוץ.

22. Genetic Interactions(Synthetic lethality) • שתי מוטציות לא לתאליות בנפרד אך לתאליות ביחד  קשר בתפקוד ותתכן אינטראקציה. • סריקה של גנום מלא ללא הטיית התוצאות. • לא מעידה על קשר באופן ישיר.

23. In Silico Predictions Through Genome Analysis • בפרוקריוטים : השתייכות לאותו אופרון. • הימצאות או העדרות באותם אורגניזמים. • הימצאות כ fusion protein. • מהיר וזול. • כיסוי גדול וממשיך לגדול באופן מהיר. • רק מנבאת. • תלויה בהשוואה מוצלחת בין אורגניזמים. • עד כה התמקדות בפרוקריוטים.

24. Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions von Mering C. et al.(2002) Nature

25. אז איזה בעיות יש לנו? • בעיות בהשוואה:תנאים שונים, פורמטים שונים, השוואה מול מאגר ידוע. • לצורך ההשוואה נבחרו קשרים בינארים. • רק 2,400 מתוך 80,000 אינטראקציות נתמכו ביותר משיטה אחת. • השיטות עדין לא הגיעו לרוייה. • False positives. • בעיתיות לסוג מסוים של קשרים.

26. Counting interactions

27. פיזור האינטראקציות ע"פ תפקידי החלבונים

28. Transport and sensing

29. חלוקה ע"פ רמות ביטוי חלבונים

30. חלוקה ע"פ מיקום בתא

31. חלוקה ע"פ מיקום בתא

33. סיכום ההשוואה • הערכה שפחות משליש מהאינטראקציות ידועות. • הערכה של יותר מ 50% false positives. • שילוב שיטות מגדיל את הדיוק. • בעיתיות בשימוש בתוצאות ממחקר אחד.

34. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Rual, J.et al (2005). Nature437 קשרים בין חלבונים באדם

35. מהלך הניסוי • מבוסס על ה Human ORFeome v1.1 - בערך 8,100 ORFs (הערכה היא כי בגנום 22,000 גנים מקודדים). • בדיקת אינטראקציות בין כל זוג- 8,100X8,100. • בספרות ידוע על כ 4,000 אינטראקציות במרחב המדגם, בניסוי נמצאו כ2,750 תוצאות . • שימוש ב Y2H משופר. • אחוז reproducibility גבוה (55%). • מעט False positives - מדגם מהתוצאות נבדק בשיטה נוספת* והראה תוצאות טובות. *Co-affinity purification GST pull down assay in human 293 cells.

37. חפיפה אדום - מחקר כחול - ספרות

38. משמעות ביולוגית • קורלציה בביטוי של גנים שהראו אינטראקציה. • גני האינטראקציות עשירים ברצפי upstream משותפים ששמורים באדם עכבר חולדה וכלב. • אותן מילות מפתח. Gene Ontology terms. • אינטראקציות בין חלבונים שהתפתחו באותו שלב באבולוציה.

39. גרף האינטראקציות (ספרות + מחקר) אדום - מחקר כחול - ספרות

40. נטייה ל"שכונות הומולוגיות" ירוק - אקראי חום - מחקר

41. טופולוגיה של הגרף • דומה ל iteractome – ים אחרים. • מספר קודקודים בעלי דרגות גבוהות – Hubs. • קשה לקבץ (No high clustering). • Subgraphs – complexes - - 102 מתוך 172 זוהו ככאלה שבהן מילה מפתח אחת מופיעה ביתר (פי 10 מרנדומלית).

42. סיכום המחקר • הערכה כי נמצא אחוז מהאינטראקציות הקיימות באדם. • ניתן ליחס משמעות ביולוגית לחלבונים שיש בניהם קשר או שנמצאים באותו תת גרף. • מפתח להבנת מחלות.

43. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery Gavin AC et al. (2006) Nature.

45. על המחקר • TAP • 6,466 ORF - כל ה ORF הידועים בשמר. • נמצאו 73% מהקומפלקסים הידועים (MIPS + ). • 74 החסרים – תנאים פיזיולוגים שונים או הפרעה של הסימון. • עם התקדמות הבדיקות פחות חלבונים חדשים זוהו – רוייה. • 64% מהקומפלקסים המוכרים זוהו מספר פעמים – כיסוי נרחב של קומפלקסים ידועים. • Socio affinity index – אינדקס שמכמת את הנטייה של זוג חלבונים להיקשר זה לזה. מבוסס על מספר הפעמים שכל חלבון נלכד ולכד בנפרד מול מספר הפעמים שהאינטראקציה הספציפית אובחנה.

46. Core – נוכח ברוב האיזופורמים Attachment – נוכחים רק בחלק מהאיזופורמים. Modules – מספר חלבונים שתמיד ביחד. (בממוצע מתחברים עם 3.3 ליבות, בסטייה של 1.6)

47. פונקציות מזוהות נמצאים או חסרים ביחד ביטוי משותף ב cell cycle קישור ב Y2H

48. מודולים שונים מצטרפים במיקומים שונים בתא

49. Attachments מספקים פונקציה מסוימת

50. מודולים וליבות מתחברים באותם איזורים פונקציונלים