Download
1 / 90
900 likes | 1.03k Vues
Transcriptional Regulation. דנה אטיאס. מנחה: פרופ' ניר פרידמן. סמינריון בביולוגיה חישובית 2006. מוטיבציה. לבקרת שעתוק תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים רבים. שימוש בטכנולוגית microarray . המידע הרב מוביל לצורך בשיטות חישוביות לשם: ניתוח המידע. זיהוי מוטיבים. הגדרת מודלים של בקרה.
E N D
Transcriptional Regulation דנה אטיאס. מנחה: פרופ' ניר פרידמן. סמינריון בביולוגיה חישובית 2006.
מוטיבציה • לבקרת שעתוק תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים רבים. • שימוש בטכנולוגית microarray. • המידע הרב מוביל לצורך בשיטות חישוביות לשם: • ניתוח המידע. • זיהוי מוטיבים. • הגדרת מודלים של בקרה.
על מה נדבר? • Genome-Wide Location Analysis • תיאור השיטה. • הפעלת השיטה על שני אקטיבטורים: Gal4, Ste12. • A plethora of sites • מספרם הרב של אתרי הקישור. • תפוצה רחבה. • מידת התאמה לרצפי קונצנזוס.
על מה נדבר ? • Control of Pancreas and Liver Gene Expression by HNF Transcription Factors • פרופיל הקישור של הפקטורים מסוג HNF בכבד ובלבלב. • כשלים ברגולציית HNF4α מעלים את רמת הסיכון לסוכרת.
על מה נדבר? • Transcriptional Regulatory Code of a Eukaryotic Genome • זיהוי מוטיבים. • מיפוי הקוד הבקרתי של השמר. • ארכיטקטורת פרומוטר. • בקרה תלוית סביבה.
Genome-Wide Location and Function of DNA Binding Proteins Ren B et al. (2000) Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290(5500):2306-2309.
unenriched IP-enriched Crosslink protein to DNAin vivo with formaldehyde Break open cells andshear DNA by sonication Immunoprecipitate Reverse-crosslinks,blunt DNA and ligateto unidirectional linkers LM-PCR Hybridize to array Location Analysis
השיטה מאפשרת: • איפיון רשתות רגולציה. • גילוי תפקידי גנים. • אישוש תפקידי גנים ידועים.
Gal4 • מאקטב גנים הנחוצים למטבוליזם של גלקטוז. • אחד מהאקטיבטורים המוכרים והנחקרים ביותר.
Gal4 • נמצאו 10 גנים אליהם נקשר Gal4ושרמת הביטוי שלהם הוכפלה בנוכחות גלקטוז. • 7 גנים שהקישור אליהם ידוע: • GAL1, GAL2, GAL3, GAL7, GAL10, GAL80, GCY1 • 3 גנים חדשים: • MTH1, PCL10, FUR4
רצף קונצנזוס של Gal4 • דומה לרצף שהוכר עד כה עבור Gal4. • נמצא באתרים רבים בגנום השמר, אליהם Gal4 לא נקשר in vivo. • ידיעת הרצף בלבד אינה מספיקה. • מבנה הכרומטין משפיע על ספציפיות הקישור.
Yeast Mating • ישנם שני סוגי זוויגים בשמר: a ו- α. • תא שמר יכול לחיות אחת משתי צורות: כתא הפלואידי או דיפלואידי. • שני תאים הפלואידים יכולים להזדווג (conjugate) וליצור תא דיפלואידי. • שמר מסוג a יכול להזדווג רק עם שמר מסוג α.
Yeast Mating • שני תאים הפלואידים. • התאים גדלים לכיוון מקור הפרומונים של הזוויג השני. • התאים מתאחדים ליצירת תא דיפלואידי.
Ste12 • פועל בתגובת תאי שמר הפלואידים ל-mating pheromone. • אקטיבצית שרשרת התגובה לפרומון גורמת ל: • עצירת מחזור התא בשלב G1. • אקטיבציה של כ-200 גנים. • מתוכם נמצאו 29 גנים המאוקטבים ע"י α-factor אליהם נקשר Ste12.
Ste12 • 11 מוכרים כגנים המשתתפים בשלבי ההזדווגות השונים. • תפקידם של רבים מהגנים הנותרים, ככל הנראה קשור להזדווגות.
Ste12 • גנים הקשורים ל-Ste12 לפני ואחרי החשיפה לפרומון: • מאוקטבים מיד לאחר החשיפה לפרומון. • הפיכת Ste12 לא פעיל לאקטיבטור . • הסרה של מעכבי Ste12. • גנים הקשורים ל-Ste12 לאחר החשיפה לפרומון: • אקטיבציה איטית. • מעורבים אקטיבטורים נוספים.
חסרונות השיטה • חסרה יכולת הבחנה בין השפעה ישירה לעקיפה. • אזור הקישור שמתקבל אינו ספציפי. • יש לשלב את השיטה עם מידע נוסף (למשל, גנומיקה השוואתית). • בעזרת שיטות חישוביות נוכל למצוא רצפים מדויקים יותר. • כל זה יבוא בהמשך...
מה עוד ניתן לבדוק ? • קשרי חלבון-חלבון. • קשרי חלבון-RNA.
A Plethora of Sites Euskirchen G, Snyder M, A plethora of sites,. (2004) Nat Genet. 36(4):325-326.
בקרת שעתוק • המטרה: לזהות אתרי קישור של פקטורי שעתוק בתאי האדם ברמת הכרומוזום. • הבעיה היא שאתרי הקישור הם קצרים מאוד (6-9 bp). • איך אפשר לאפיין רצפים קצרים כ"כ מתוך גנום האדם שאורכו כ-3 ביליוני בסיסים ?
ChIP-chip • הטכנולוגיה נוסתה ראשית בשמר. • יישום השיטה למציאת אתרי קישור של פקטורי שעתוק בגנום האדם. • מיפוי NF-κB ו-CREB בכרומוזום 22. • מיפוי Sp1, c-Myc ו-p53 בכרומוזומים 21 ו-22.
תוצאות • עבור NF-κB, CREB, c-Myc ו-Sp1 התגלו כמויות עצומות של אתרי קישור: • כ-12,000 על כרומוזום 21. • כ-25,000 על כרומוזום 22. • נמצא קישור ליד גנים שתפקידם מתועד היטב וגם ליד גנים שתפקידם אינו ידוע.
תוצאות • מס' גנים שמבקרים NF-κB ו-CREB מקודדים בעצמם לפקטורי שעתוק. • מעיד על קיום שרשראות רגולציה,Regulatory cascade.
תפוצה רחבה • אתרי קישור באדם: • הרחק מאזור התחלת השעתוק. • בתוך גנים. • 9-27% מאתרי הקישור נמצאים באזור 1 kb מתחילת הגן. • עבור NF-κB ו-CREB, כ-25% נמצאים באזור 1-10 kb מהגן.
תפוצה רחבה • 40% מהאתרים נמצאים בתוך אינטרונים. • אתרים רבים נמצאים באזור '3 של הגן. • רגולציה של שעתוק anti-sense. • קיימים פקטורים שנקשרים בצד '5 ו-'3.
אין התאמה מלאה • בהשוואה בין רצפי קונצנזוס של פקטורים לבין אתרי הקישור בפועל נמצא: • רק כ- 2-35% מאתרי הקישור מתאימים בדיוק לרצף הקונצנזוס. • קישורים רבים נעשים דרך אתרים דומים אך שונים. • קישור דרך גורמים מתווכים.
אין התאמה מלאה • בבחינת NF-κB ו-CREB נמצא שהם מאקטבים גנים חסרי אתר קישור מתאים. • מצביע על בקרה לא ישירה. • נמצא ש- NF-κB מתפקד גם כרפרסור. • פקטורים רבים יכולים לשמש כאקטיבטורים וגם כרפרסורים.
מסקנות • בכל אחד מהמחקרים נמצאו אתרי קישור רבים. • מהי תרומתו של כל אתר למערך הרגולציה הכולל ? • ייתכן כי קיים עודף של אתרי קישור. • ייתכן שאתרים מסוימים מבקרים גנים לא פונקציונליים. « קיים "רעש" רגולטורי.
סיכום • המחקרים מראים לראשונה כי ניתן למפות אתרי רגולציה על כרומוזומים שלמים in vivo. • ומה הלאה ? • ניתוח ~1500 פקטורי שעתוק באדם. • מיפוי בקרתי של ~250 סוגי תאים ביונקים.
Control of Pancreas and Liver Gene Expression by HNF Transcription Factors Odom T et al. (2004) Control of Pancreas and Liver Gene Expression by HNF Transcription Factors. Science. 303:1378-1381.
איי לנגרהנס – Islets of Langerhans • תאים אנדוקרינים בלבלב המפרישים הורמונים. • תאי α – גלוקגון. • תאי β – אינסולין. • תאי דלתא – סומטוסטטין. • תאי PP –Pancreatic polypeptide .
Hepatocytes • תאים המהווים כ-60-80% ממסת הכבד. • אחראים על: • סינתזת חלבונים. • מטבוליזם של סוכרים. • מטבוליזם של ליפידים. • Detoxification – אינאקטיבציה ומטבוליזם של סמים וסטרואידים.
פקטורי השעתוק הנחקרים • HNF1α, HNF6, HNF4α: • בכבד – פועלים בצורה קואופרטיבית. • בלבלב – מנגנון הרגולציה אינו מוכר. • שלושתם נחוצים לשם פעילות תקינה בכבד ובלבלב. • מוטציות ב-HNF1α וב-HNF4α גורמות לסוכרת.
Genome-Wide Location Analysis • Microarray שמכיל 13,000 גנים. • עבור כל גן נכללים האזורים: • 700 bp upstream. • 200 bp downstream.
תוצאות • HNF4α מבקר: • ~12% מהגנים במערך ה- Hepatocytes. • ~11% מהגנים במערך ה- Pancreatic Islets .
בדיקת אמינות התוצאות • נעשו מס' ניסויים בלתי-תלויים ע"מ לוודא את נכונות התוצאות. • בעיות אפשריות שנבדקו: • ספציפיות נמוכה של נוגדנים. • בעיות באנליזה של ה-microarray.
בדיקת אמינות התוצאות • שימוש ב-2 נוגדנים שונים. • בדיקת ספציפיות הנוגדנים. • ווידוא הקישור בשיטות נוספות. • שימוש בנוגדנים עבור פקטורים אחרים. • מסקנה: HNF4α פעיל מאוד ברקמות הנבדקות.
בדיקת קישור ל-RNA Polymerase II • מתוך הגנים הקשורים ל-RNA Polymerase II: • 42% קשורים ל-HNF4α ב- Hepatocytes. • 43% קשורים ל-HNF4α ב- Pancreatic Islets.
בדיקת קישור ל-RNA Polymerase II • ביטוי יתר של HNF4α עלול לפגוע בהפרשת אינסולין תקינה בתאי β.
רשתות רגולציה העלאת הסיכון לחלות בסוכרת.
Transcriptional Regulatory Code of a Eukaryotic Genome Harbison CT et al. (2004) Transcriptional regulatory code of a eukaryotic genome. Nature. 431:99-104.
שימוש בשיטות מוכרות • גנומיקה השוואתית: • נמצאו אתרים ציס-רגולטורים שמורים בגנום השמר. • Genome-Wide Location Analysis: • נחקר אופי הקישור של 203 פקטורי שעתוק במדיה עשירה. • 84 מהם נחקרו תחת תנאים נוספים. • נבדקו האזורים שבין הגנים בשמר. • ידע קודם.
