Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren

1. Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 04

2. Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren • Nukleinsäureextrakion: • Isolierung • Reinigung • Konzentrationsbestimmung • Nukleinsäureextrakion genomischer DNA • Nukleinsäureextrakion niedermolekularer DNA • Analyse: • Elektrophorese • Färbung • Zusammenfassung

3. Nukleinsäureextraktion • Aufgereinigte Nukleinsäureextrakte Grundvoraussetzung der Nukleinsäureanalytik • Verunreinigungen: Nukleasen, Nukleinsäuren anderer Art, Salze, Makromoleküle • Grundsätzliche Verfahrensschritte: • Isolierung • Reinigung • Konzentrationsbestimmung • Analyse • Verfahren abhängig von Species, Nukleinsäuretypus und weiterer Anwendung

4. 1.1. Isolierung • Isolierung genomischer DNA: • Isolierung niedermolekularer DNA:

5. 1.1. Isolierung • Aufschluss • mit Detergenzien, z.B. SDS • durch Enzyme, z.B. Lysozym bei Bakterien • Mechanischer Aufschluß • Kochen • Proteindenaturierung • Proteinase K (Protease) • chemisch: Phenolisierung, SDS, NaOH

6. 1.2. Reinigung Phenolextraktion: • Ausschütteln mit Wasser - Phenol: • Phenol denaturiert Proteine, nach Zentrifugation: wässrige Nukleinsäurelösung – Proteine in Interphase oder Phenolphase • Ausschütteln mit Wasser - Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol: • stabilere Phasengrenze, gründlichere Denaturierung • Phenolisierung wiederholen, bis Interphase sich nicht mehr bildet

7. Phenolextraktion:

8. 1.2. Reinigung Gelfiltration • „Molekularsiebeffekt“: große DNA-Moleküle dringen nicht in Gelporen ein – eluieren schneller als niedermolekulare DNA • Fraktionierte Sammlung des Eluats

9. 1.2. Reinigung Ethanolpräzipitation: • Ausfällung der Nukleinsäure mit Ethanol + monovalente Kationen • Konzentrierungseffekt, waschen mit 70% Ethanol

10. 1.3. Konzentrationsbestimmung Photometrische Konzentrationsbestimmung: • Adsorptionsmaximum doppelsträngiger DNA bei 260 nm durch aromatische Ringe der Basen • 50μg/ml doppelsträngige DNA hat Adsorptionswert von 1 (Vorraussetzung: 1cm Schichtdicke, Quarzküvette) • Hyperchromie: einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle besitzen höhere Adsorption (1 OD260 entspricht 33 μg/ml RNA bzw. 40 μg/ml einzelsträngiger DNA) • Konzentrationsbestimmung kurzer Oligonukleotide über Summe der Adsorptionskoeffizienten der einzelnen Basen • Bestimmung der Reinheit: Messung OD260/OD280-Wert (1,8 = rein)

11. 1.3. Konzentrationsbestimmung Ethidiumbromidanfärbung: • bei geringen Nukleinsäuremengen: Bestimmung der Konzentration durch Ethidiumbromidanfärbung – Vergleich mit Verdünnungsreihe • planare Struktur - interkaliert in die Nukleinsäure durch Interaktion der aromatischen/heteroaromatischen Ringe

12. 2.1 Isolierung genomischer DNA • Zellwandaufschluss und Proteinabbau • Proteinase K: Serinprotease, schneidet relativ unspezifisch, nicht • hemmbar durch Ionen/EDTA, benötigt SDS

13. 2.2: Reinigung genomischer DNA • Molekülgrößen um 80 kbp: • Aufschluss und Proteindenaturierung durch Guanidium-Hydrochlorid • DNA-Isolation durch Ethanolfällung • Anwendung: Southern-Blot, PCR • Molekülgrößen 100-150 kbp: • Phenolextraktion • DNA an Phasengrenze Wasser-Phenol • DNA-Entnahme durch Aufrollen auf steriles Stäbchen • Anwendung: Southern-Blot, Genombanken mit Phage λ • Molekülgröße > 200 kbp: • Denaturierung von Proteinase K und Protein-DNA-Komplexen durch Formamid • Dialyse in Collodion-Schläuchen → minimale Scherkräfte • Anwendung: Cosmidbanken

14. 3.1: Isolierung niedermolekularer DNA • Anzucht: • Mini- (<10ml), Midi- (<100ml), Maxi- Präparationen (>100ml Bakterienkultur) • Steigerung der Plasmidausbeute durch selektive Amplifikation (Translationsinhibitoren) • Aufschluss:

15. 3.1: Isolierung niedermolekularer DNA • alkalische Lyse: • EDTA, RNase, 95°C, • SDS-Lyse, NaOH-denaturiert DNA • Plasmid-Renaturierung durch Kaliumdodecylsulfat • Abzentrifugation unlöslicher Komponenten • Fällung mit Ethanol oder Isopropanol – waschen • schnelle Methode – zum Austesten von Klonierungen • Kochlyse: • Lysozym, aufkochen, abzentrifugieren denaturierter Bestandteile • DNA in Lösung, gegebenenfalls Phenolisierung der DNA gegen Endonuclease – Präzipitation

16. 3.1: Isolierung niedermolekularer DNA • Lithium-Methode: • Triton 100X (Detergenz)/LiCl – Auflösung der Plasmamembran • Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol denaturiert Proteine/Membranen • Plasmid-DNA bleibt gelöst • SDS-Lyse: • Lyse durch SDS, partielle Fällung chromosomaler DNA durch NaCl • nach Zentrifugation – Plasmide im Überstand • geeignet für große Plasmide

17. 3.2. Reinigung niedermolekularer DNA • Reinigung über Anionenaustauschersäulen: • negativ geladene DNA bindet an positiv geladenes Säulenmaterial (z.B. DEAE) • degradierte Proteine/RNA binden nicht • Auswaschen der DNA mit hohen Salzkonzentrationen

18. 3.2. Reinigung niedermolekularer DNA • Dichtegradientenzentrifugation: • Zentrifugation in CsCl-Gradient + Ethidiumbromid liefert hochreine DNA • Ethidiumbromid interkaliert stärker in lineare als zirkuläre DNA → Dichteunterschiede (Proteine: geringere Dichte, RNA pelletiert) • Auswaschung: Ethidiumbromid mit n-Butanol, CsCl durch Dialyse

19. Analyse • Wie groß sind extrahierte Nukleinsäuren? • In welcher Konformation liegt Nukleinsäure vor? • Sind eventuell transformierte Elemente eingebaut worden? Analyseverfahren: • Auftrennung durch Gelelektrophorese • Anfärbung

20. 4.1: Analyse - Gelelektrophorese • Trägermaterial: Agarose oder Polyacrylamid • Nukleinsäuren negativ geladen (Phosphatgruppen) • Verhältnis Ladung : Molekulargewicht ist konstant • Trennung im Gel nach Molekülgrößen • Ogston-Siebeffekt (globuläre DNA)/ Reptationstheorie (lineare DNA)

21. 4.1: Analyse - Gelelektrophorese Auftrennung in Agarosegelen: • Wanderungsgeschw. abh. von Agarosekonz., Spannung, Laufpuffer, interkalierenden Farbstoffen • denaturierende Bedingungen um Sekundärstrukturbildung zu verhinden • Trennung linearer, doppelsträngiger DNA: lineare Abh. von log Länge (bp) zu Wanderungsdistanz • Trennung zirkulärer DNA: superhelical > linear > relaxiert →(Abb)

22. 4.2: Analyse - Anfärbung Ethidiumbromid: • Anregung unter UV-Licht, Nachweisgrenze: 10-20 ng • ändert Konformation zirkulärer DNA-Moleküle SYBR Green/TOTO1/YOYO1: • Fluoreszenzfarbstoffe – sensitiver (binden mit höherer Affinität) und weniger mutagen als Ethidiumbromid Silberfärbung: • extrem sensitiv: Nachweisgrenze 0,03 ng/mm², nicht mutagen - Reduktion von Silbernitrat zu reinem Silber • Nachteil: zeitaufwendig, hohe Hintergrundfärbung

23. Zusammenfassung Nukleinsäureextraktion: • Isolierung • Reinigung • Konzentrationsbestimmung • Analyse • Verfahren abhängig von Größe und Art der Nukleinsäure, Ausgangsorganismus und Verwendungszweck

24. The End!!