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IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI

IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI. Enrico Tortoli. L’approccio tradizionale. Test biochimici Test colturali. Test biochimici. Accumulo di niacina Riduzione dei nitrati Catalasi a 68°C semiquantitativa Idrolisi del Tween 80 Ureasi Riduzione del tellurito Arilsolfatasi β-glucosidasi.

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IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI

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Presentation Transcript

  1. IDENTIFICAZIONE DEI MICOBATTERI Enrico Tortoli

  2. L’approccio tradizionale • Test biochimici • Test colturali

  3. Test biochimici • Accumulo di niacina • Riduzione dei nitrati • Catalasi • a 68°C • semiquantitativa • Idrolisi del Tween 80 • Ureasi • Riduzione del tellurito • Arilsolfatasi • β-glucosidasi

  4. Niacina • Prodotto del metabolismo micobatterico accumulato nel terreno • requisiti della coltura • l’estrazione • la rivelazione • 24 ore • Distingue M. tuberculosis dalle altre specie • Irregolarmente positiva in M. simiae • Raramente positiva in altri micobatteri

  5. Nitrati • Molte specie micobatteriche sono in grado di ridurre i nitrati a nitriti • 4 ore

  6. Catalasi a 68°C • Praticamente tutti i micobatteri producono catalasi • In quasi tutte le specie, ad eccezione di quelle del M.tuberculosis complex la catalasi è termoresistente • incubazione a 68°C per 20 min • rivelazione con H2O2 • 20 min

  7. Idrolisi del Tween 80 • Alcuni micobatteri possiedono una esterasi, grazie ad essa sono in grado di idrolizzare il Tween 80 • Utilizzando Tween legato a rosso neutro, l’idrolisi è evidenziata dal viraggio al rosso • 10 giorni

  8. Test colturali • Velocità di crescita • Temperature di crescita • Pigmento • Morfologia delle colonie • Test di inibizione selettiva

  9. Velocità di crescita • I micobatteri a crescita rapida formano colonie visibili ad occhio nudo in meno di una settimana • I micobatteri a crescita lenta possono richiedere anche 6 settimane • Il test deve essere eseguito utilizzando un inoculo standardizzato Il tempo richiesto per la crescita nella coltura primaria non è indicativo • Il tempo richiesto per la crescita in coltura liquida non è indicativo

  10. Temperature di crescita • Il range delle temperatura che permettono lo sviluppo delle varie specie batteriche è ampio • Oltre all’incubazione a 37°C è necessario testare almeno altre due temperature, 25-30°C e 42‑45°C

  11. Pigmento • I micobatteri si distinguono in: • non cromogeni • scotocromogeni • fotocromogeni

  12. Morfologia delle colonie • Aspetto macroscopico • Aspetto microscopico (10x)

  13. Morfologia delle colonie M. tuberculosis

  14. Morfologia delle colonie M. xenopi

  15. Morfologia delle colonie M. avium

  16. Test di inibizione selettiva • L’aggiunta al terreno di particolari sostanze permette di distinguere le specie che ne tollerano la presenza, da quelle che ne risultano inibite • TCH • NaCl • Tiacetazone • Idrossilamina • (MacConkey)

  17. Identificazione • Confronto dei risultati dei test con i dati presenti in letteratura (tabelle)

  18. Conclusioni • Non esistono kit commerciali • I tempi sono estremamente lunghi • Non tutti i test sono perfettamente riproducibili • L’affidabilità delle identificazioni è buona solo per le specie più comuni • Non permettono di riconoscere i micobatteri rari o “nuovi” • Alcuni test possono essere utilizzati, in maniera mirata, per dirimere ambiguità emergenti da altri sistemi di identificazione • Permettono di differenziare M. tuberculosis dalle altre specie del M. tuberculosis complex

  19. L’analisi dei lipidi • La parete dei micobatteri è caratterizzata da un contenuto lipidico elevatissimo • Acidi micolici • Acidi grassi saturi ed insaturi • Alcol

  20. Gli acidi micolici • Acidi grassi, ramificati in posizione β • Presenti nella parete batterica dei generi: • Corynebacterium: 22-38 atomi di C • Rhodococcus: 34-52 atomi di C • Nocardia: 44-60 atomi di C • Gordonia: 48-66 atomi di C • Tsukamurella: 64-78 atomi di C • Mycobacterium: 60-90 atomi di C • Presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici • alfa-, alfa'-, metoxi-, keto-, epoxi-, waxester-, omega'metoxi-mycolati

  21. altri lipidi complessi acidi micolici arabino-galattano peptidoglicano • membrana cellulare La parete dei micobatteri

  22. Cromatografia su strato sottile • Separazione, mediante opportuni solventi, dei vari acidi micolici presenti nell’estratto depositato su una piastra di gel di silice • Evidenziamento degli stessi dopo idonea colorazione • Identificazione delle “macchie” in base alla loro posizione rispetto al fronte di avanzamento del solvente (fase mobile) • Identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi micolici

  23. Cromatografia su strato sottile

  24. Gas-cromatografia • Pirolisi degli acidi micolici in esteri metilici saturi di 22, 24 e 26 atomi di C • Separazione gas-cromatografica dei prodotti di clivaggio nonché degli acidi grassi saturi ed insaturi (fra i quali l’acido tuberculostearico) e degli alcol • Identificazione delle catene di C preferibilmente usando la spettrometria di massa • Identificazione del microorganismo in base al pattern di acidi grassi

  25. Gas-cromatografia

  26. Il principio della HPLC • La fase mobile è spinta ad elevata pressione attraverso la fase stazionaria (particelle paccate) contenuta nella colonna • Il campione viene iniettato direttamente all'interno del flusso della fase mobile • La separazione delle varie frazioni del campione è determinata dalla diversa polarità delle due fasi • Le frazioni eluite vengono quantificate in base alla loro assorbanza

  27. colonna iniettore pompe detector solventi recorder cromatogramma Le componenti del sistema

  28. Preparazione del campione • Saponificazione • un’ansata di colonie in potassa alcolica per 1h a 121°C • Estrazione • aggiunta di cloroformio dopo acidificazione • evaporazione dello strato non acquoso • aggiunta di bicarbonato ed ulteriore evaporazione • solubilizzazione del residuo secco in cloroformio • Derivatizzazione • esterificazione con bromofenacil bromuro, in presenza di catalizzatore, per 40 min a 80°C • evaporazione e aggiunta al residuo secco di cloroformio, ac.cloridrico e metanolo • recupero ed evaporazione dello strato di cloroformio

  29. Identificazione dei picchi 1 TRR=5,3/9,6 SI 5,3 9,6

  30. Identificazione dei picchi 2 SI1 SI2

  31. Esempi di profili HPLC M. tuberculosis M. simiae

  32. Conclusioni • TLC: il numero di specie con pattern sovrapponibili è molto elevato • GLC: difficile standardizzazione della metodica; le differenze quantitative sono difficilmente interpretabili • HPLC: elevato potere discriminante, ma il numero delle specie non differenziabili è in continua crescita

  33. PCR Restriction Analysis • hsp65: gene altamente conservato • Digestione con un enzima di restrizione specifico per un sito di restrizione non molto frequente • Determinazione del pattern di restrizione in base al numero ed alle dimensioni dei frammenti ottenuti • Confronto con pattern di restrizione appartenenti a specie note

  34. Il metodo • Amplificazione di una porzione di 439 bp all’interno del hsp65 • Digestione di 2 aliquote di amplificato usando, su ciascuna, un diverso enzima di restrizione • Separazione elettroforetica dei prodotti di digestione presenti in ciascuna aliquota di amplificato • Determinazione, per confronto con pesi molecolari noti, delle dimensioni dei frammenti (quelli inferiori a 40 pb vengono ignorati) • Uso di un algoritmo per raggiungere l’identificazione di specie

  35. Gli enzimi di restrizione • BstEII • nessuna digestione (440 bp) • produzione di 2-3 frammenti (320-80 bp) • HaeIII • produzione di 2-5 frammenti (265-40 bp)

  36. BstEII 200/60/50 bp M. chelonae 150/105 bp M. haemophilum 130 bp HaeIII 320 bp 185/130 bp M. terrae 145/130/50 bp M. simiae 130/115/60 bp M. gordonae 130/95/75/60 bp M. kansasii . . . . . . 120 bp hsp65 PRA: l’algoritmo • Differenziazione delle specie, all’interno del pattern di restrizione prodotto da BstEII, in base al pattern prodotto da HaeIII

  37. Sviluppi • Determinazione delle dimensioni esatte dei frammenti mediante sequenziamento • Presenza di un sito Internet (PRA-Site) contenente tutti i pattern di restrizione delle specie batteriche note

  38. Di facile esecuzione ed economico Svariate specie sono caratterizzate da più di un pattern (fino a 9) Alcune specie hanno pattern indistinguibili Conclusioni

  39. DNA-probe • Enorme risparmio di tempo rispetto all’identificazione tradizionale • Specificità elevata • Disponibili per un numero limitato di specie • Costose

  40. DNA-probe commerciali • AccuProbe (GenProbe) • INNO LiPA Mycobacterium (Innogenetic) • GenoType Mycobacteria (Hain)

  41. AccuProbe • Bersaglio: rRNA 16S • Reazione: ibridizzazione in fase liquida, direttamente dalle colonie • Rivelazione: in chemioluminescenza (HPA) • Specificità: • M. tuberculosis complex • MAC o, in alternativa, M. avium e M. intracellulare separatamente • M. kansasii • M. gordonae • Limiti: • test a cascata • non disponibili per specie comuni in Europa ma rare negli USA

  42. Ibridizzazione inversa

  43. INNO LiPA Mycobacterium • Bersaglio: regione spaziatrice fra i geni codificanti per rRNA 16S e 23S • Reazione: ibridizzazione inversa, con 21 sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) • Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) • Specificità: • Mycobacterium genere • M. tuberculosis complex • M. kansasii (differenziazione dei tipi I, II, III-IV-V-M. gastri) • M. xenopi • M. gordonae • M. avium • M. intracellulare • M. chimaera • MAC • M. scrofulaceum • M. fortuitum • M. marinum-M. ulcerans • M. genavense • M. haemophilum • M. chelonae (differenziazione dei tipi I, III, II-IV) • M. smegmatis • M. malmoense • M. celatum • M. simiae • Limiti: • alcune reattività crociate con specie rare

  44. GenoType Mycobacteria • Bersaglio: gene codificante per rRNA 23S • Reazione: ibridizzazione inversa del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) con varie sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa • Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) • Specificità: • Mycobacterium genere • M. tuberculosis complex • M. kansasii-M. gastri • M. xenopi • M. gordonae • M. avium • M. intracellulare • M. scrofulaceum-M. parascrofulaceum-M. paraffinicum • M. malmoense-M. haemophilum-M.palustre-M. nebraskense • M. peregrinum-M. alvei-M. septicum • M. chelonae-M. immunogenum • M. fortuitum-M. mageritense • M. abscessus-M. immunogenum • M. interjectum • M. marinum-M. ulcerans • Mycobacterium genere • M. simiae • M. mucogenicum-M. ratisbonense • M. celatum I, III • M. phlei • M. szulgai-M. intermedium • M. immunogenum • M. haemophilum-M. nebraskense • M. ulcerans • M. gastri • M. lentiflavum • M. heckeshornense • M. shimoidei • M. genavense-M. triplex • Limiti: • incorretta identificazione dei MAC non-M. avium, non-M. intracellulare • alcune reattività crociate con specie rare • numerose identificazioni non univoche

  45. GenoType Mycobacteria MTBC • Bersaglio • gene codificante per rRNA 23S • gene girB • regione RD1 • Reazione: ibridizzazione inversa, con 9 sonde immobilizzate su una striscia di cellulosa, del bersaglio amplificato mediante PCR (primer biotinilati) • Rivelazione: colorimetrica (avidina-perossidasi) • Specificità: • M. tuberculosis complex • M. tuberculosis • M. africanum tipo I • M. microti • M. bovis • M. bovis BCG • M. caprae • Limiti: • mancato riconoscimento di M. africanum tipo II, di M. canettii e di M. pinnipedii

  46. Identificazione mediante sequenziamento genico

  47. Prima del sequenziamento • Scelta del bersaglio • Presente in tutti gli organismi • Conservato ma contenente regioni variabili • Disponibilità di un database contenente le sequenze con cui si vuol confrontare il bersaglio • Scelta dei primer • Estrazione del DNA dalle cellule

  48. Le fasi del sequenziamento • Amplificazione del bersaglio • Verifica dell’amplificato • Purificazione • PCR di sequenziamento • Purificazione dell’amplificato

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