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MUERTE CELULAR APOPTÓTICA IN VITRO DURANTE LA DIFERENCIACIÓN ERITROIDE

MUERTE CELULAR APOPTÓTICA IN VITRO DURANTE LA DIFERENCIACIÓN ERITROIDE. Zamai et al . Apoptosis 9:235-246, 2004. ERITROPOYESIS Stem cells  células eritroides tempranas y tardías  eritrocitos Diferenciación eritroide : -  sensibilidad a EPO

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MUERTE CELULAR APOPTÓTICA IN VITRO DURANTE LA DIFERENCIACIÓN ERITROIDE

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  1. MUERTE CELULAR APOPTÓTICA IN VITRO DURANTE LA DIFERENCIACIÓN ERITROIDE Zamai et al. Apoptosis 9:235-246, 2004

  2. ERITROPOYESIS Stem cells  células eritroides tempranas y tardías  eritrocitos Diferenciación eritroide: -  sensibilidad a EPO -  Glicoforina A -  CD45 - cambios nucleares - pérdida organelas - síntesis Hb

  3. ANTECEDENTES Médula ósea normal eritroblastos apoptóticos Eritroblastos inmadurosreceptores de muerte (Fas, TRAIL-R1 y TRAIL-R2) Eritroblastos maduros, macrófagos y células NK inmaduras  ligandos FasL y TRAIL Homeostasis  balance EPO vs. TRAIL y FasL

  4. OBJETIVO Caracterizar la muerte de células eritroides que ocurre in vitro MÉTODOS Sangre  células mononucleares  CD34+  cultivo en medio sin suero (+ SCF + EPO + IL-3) Diferenciación unilinaje población homogénea de células

  5. CITOMETRIA DE FLUJO • Ag de membrana (CD34, CD45, Glicoforina A) • - Ag intracelulares(HbA y HbF) • Características apoptóticas / Ciclo celular: • Anexina-V • Coloración supravital con IP • FSC – SSC • EtOH permeabilización + IP

  6. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)  características ultraestructurales Electroforesis de ADN (ladder)  fragmentación del ADN Microscopía de fluorescencia  TUNELmarcación de 0H 3’ (dUTP-FITC)

  7. CITOMETRIA DE FLUJO: (seguimiento de la diferenciación) Gli+ (low-int)  % Gli+ (intenso) FSC  SSC  % Gli+ (intenso)  FSC  SSC (tamaño) (complejidad)

  8. Tinción con bencidina 20-25% Citometría de flujo: detección de HbF y HbA 80%

  9. Microscopía electrónica de transmisión de células eritroides

  10. Citometría de flujo: expresión de CD45 Tinción con May-Grünwald-Giensa R1 = eritroide R2 = mieloide temprana + blastos R3 = mieloide tardía + neutrófilos R4 = monocitos R5 = células muertas

  11. CITOMETRIA DE FLUJO: Glicoforina A vs. Anexina-V-FITC Gli débil/Anx-V+ Gli neg / Anx-V+  Gli débil/Anx-V+  Gli débil/Anx-V+

  12. Microscopía electrónica de transmisión de células apoptóticas

  13. Citometría de flujo: ciclo celular Ladder de ADN

  14. Microscopía de fluorescencia:Reacción TUNEL

  15. DISCUSIÓN Diferenciación asociada con apoptosis Células eritroides tienen particular tendencia a apoptosis (característica intrínseca?) Progenitores eritroides con distinta sensitividad a EPO

  16. DIFERENCIACIÓN ERITROIDE  Glicoforina A Hemoglobina adulta Tamaño Complejidad Material granular  Hemoglobina APOPTOSIS Anx-V+ Alteraciones nucleares Pico subdiploide Fragmentación ADN Hipótesis: apoptosis se induce en el estadio del eritroblasto basófilo

  17. CONCLUSIÓN El incremento paralelo de células apoptóticas y células eritroides maduras, sugiere que la interacción entre eritroblastos inmaduros y maduros (donde los últimos pueden ejercer una actividad citotóxica sobre los primeros) contribuye a inducir apoptosis durante la diferenciación eritroide in vitro. Este proceso podría representar una reproducción del feedback regulatorio negativo observado en las islas eritroblásticas de la médula ósea.

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