300 likes | 1.41k Vues
ELEKTROFOREZ NEDIR?. - Elektroforez genel anlamda,
E N D
1. ELEKTROFORETIK YNTEMLER MEHMET FUAT GLHAN
2010
2. ELEKTROFOREZ NEDIR? - Elektroforez genel anlamda, zel bir sivi ortamda, paraciklarin ierdikleri elektriksel yke gre farkli hizda ve farkli ynde hareket etmesi sonucu, btn bir maddenin yapisindaki farkli maddelerin ayirt edilebilmesini saglayan bir inceleme yntemidir.
- Ilk kez 1937 yilinda Arne tiselius tarafindan gelistirilmis olan elektroforezden, zellikle tipta ve biyokimyada, kandaki esitli protein ve lipitlerin ayrilmasi, taninmasi ve miktarinin llmesinde yararlanilir. Ayrica elektroforezden sanayide yaygin biimde yararlanilmaktadir.
3. ALISMA PRENSIBI - Elektroforezin alisma ilkesi; molekl agirligi ve moleklde bulunan elektrik enerjisinin jel iinden bir ykten digerine giderken kat ettigi mesafe farkliliklarini ele almaktir. Bu farkliliklara gre enzim ya da proteinin birbirinden farki anlasabilir.
- Anyonlar anoda, katyonlar katoda hareket ederler. Molekllerin elektroforezdeki hizini etkileyen esitli faktrlerde vardir.
5. Elektroforez iin drt seye ihtiya vardir: -Iyonlarin hareket edebilecegi uygun bir destek ortami (kagit,selloz asetat,nisasta,agaroz jeli ya da poliakrilamit)
-Elektriksel alani olusturmak iin dogru akim saglayacak g kaynagi
-Uygun pHda bir tampon zelti
-Birbirinden ayrilan bantlari kantitatif olarak degerlendirebilen dansitometre.
6. G KAYNAGI - Elektrotlar arasinda elektrik akimi saglar.
- G hizinin artmasi,
- Ayirt edilen molekllerin buharlasmasi,
- Su kaybi,
- Iyon konsantrasyonunun artmasi,
- Tampon viskozitesinde azalma direncinin dsmesi,
- Bu problemleri en aza indirmek iin: sabit akimli g kaynagi kullanilmalidir.
7. Tamponlar - Elektrik akimini tasimak
- Elektroforezin yrtldgu pHyi belirlemek
- Yrtlen moleklun elektriksel ykn belirlemek
Tamponun iyonik gc ise ;
- Iyonik bulutun kalinlasmasi
- Migrasyon orani
- Elektroforetik zonlarin daha keskin ayrilmasi
- Molekllerin hareket etmesinde nemlidir.
- Barbital tamponlar & Tris-borik asid-
- EDTA tamponlari en iyi bilinen tamponlardir.
8. BOYAMA - Elektroforez tamamlandiktan sonra destek ortami bir boya ile muamele edilerek ayrilmis fraksiyonlarin identifikasyonu saglanir.
-Numune tarafindan alinan
boyanin miktari ;
- proteinin tipine
- sabitleyici ajanlarin olusturdugu
denatrasyon derecesine baglidir.
En iyi bilinen boyalar ;
9. Elektroforetik Mobilite (U) Alana uygulanan g basina g hizidir.
iki denklemden tretilmistir;
1 .Elektrik alanin iyon zerine olusturdugu hareket gc
Fe = qE : q net yuk, E ise elektrik alan gc
2. Buna zit olarak destek ortamin srtnme direnci sonucu olusan hareketi engelleyici gtr
Fs = fv : f srtnme gc , v hiz
3. qE = fv
4. Sonu olarak, Elektroforetik mobilite (U) = v/E = q/f = q/6p?r :
? destek ortamin viskozitesi, r molekln api
10. Bu formle gre, elektroforetik mobilite net yk ile dogru ;molekl byklg ve elektroforetik ortamin viskozitesi ileters orantilidir.
11. Elektroforezde G Hizi
- Molekln net elektriksel ykne
- Molekln yapisi ve byklgne
- Elektriksel alanin gcne
- Destek ortamin zelligine
- Uygulama isisina baglidir
12. Elektroforezin genel prosedr a.Uygulama
b.Yrtme
c.Boyama
d.Temizleme
e. Seffaflastirma
f. Degerlendirme
13. Uygulama ve yrtme:
Teknige,sreye ve analizin esidine gre degisebilir.
Boyama:
Sadece incelenecek maddeyi boyayan boyalar kullanilir.
Temizleme:
Normalde destek ortami boya iine kondugunda tamamen boyanir.Ancak biz sadece incelenecek kismin boyali kalmasini isteriz. Bu nedenle de destek ortami belli bir temizleme sivisinda bir sre tutulur. (% 5 asetik asit)
Seffaflastirma:
Dansitometre de okuma yapilabilmesi iin destek ortaminin seffaf olmasi gerekir.Bunun iin %30-40 dimetil slfoksit veya diger seffaflastiricilar kullanilabilir.
Degerlendirme:
Dansitometre de yapilir.
14. Elektroforez esitleri
-Kgit elektroforezi
- Selloz asetat elektroforezi
- Jel elektroforezi
- a)Agaroz jel elektroforezi
-b)Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)
- SDS-poliakrilamid jel elektroforezi
- Kapiller elektroforez
- Immnoelektroforez
- Nisasta jeli elektroforezi
15. Kagit elektroforezi - Hem rutin hem de arastirma maksatli olarak kullanilabilir. Destek ortami olarak kaliteli filtre kagidi kullanilir. Metodun avantaji, ucuz ve yksek gerilime dayanabilmesidir. Ancak deney sresi uzun oldugundan rutinde pek kullanilmaz. zellikle aminoasitlerin ayriminda kullanilir.
16. Selloz asetat elektroforezi Sellozun hidroksil gruplari, asetik anhidrit ile reaksiyona sokulursa selloz asetat elde edilir.
Avantajlari:
Hem elektroforez sresi kisa (30-0 dk) hemde deney bittikten sonra numuneleri uzun sre korumak mmkn oldugundan rutinde sik kullanilir.
Dezavantajlari:
Rezolsyon jeldeki kadar iyi degildir. En nemli dezavantaji da
standardizasyonu iyi degildir. Ayni firmaca retilen ayni parti
iinde bile farkliliklar grlebilir.
17. Agaroz jel elektroforezi - Destek maddesi olarak bir karbonhidrat polimeri olan agaroz veya agaropektin kullanilir. Bu maddelerin proteinlere affinitesi az oldugundan protein bantlari birbirinden daha iyi ayrilir. Ayrica ok iyi seffaflastiklari iin dansitometrik degerlendirmeleri daha gvenilirdir. Bu nedenle rutin uygulamalarda sika kullanilmaktadir. Deney sreside olduka kisadir (30-90 dk.)
- Serum proteinleri, nkleik asitler, hemoglobin varyantlari, laktat dehidrogenaz ve kreatin kinaz izoenzimleri, lipoprotein fraksiyonlari ve diger bazi maddelerin analizlerinde basari ile kullanilmaktadir.
19. Nisasta jeli elektroforezi - Destek materyali olarak nisasta kullanilir.
Nisasta jel elektroforezi hem yzey yk, hem de molekl byklgne bagli olarak ayirt edilen makromolekler iyonlarin zelliklerinin anlasilmasina izin verir. Dogal nisasta jellesmediginden kismen hidrolize olarak kullanilir.
- Agaroz jelde oldugu gibi, nisasta jelde de islem horizontal olarak gereklestirilebilir.
20. Poliakrilamid jeli elektroforezi -Poliakrilamid jel
elektroforezinde 20 yada
daha fazla fraksiyon elde
edilir.
-Bu nedenle genetik
varyantlar ve izoenzim
analizleri olmak zere,
protein ve nkleik asit
alismalarinda tercih edilir.
-Separasyon; molekllerin
byklgne ve ykne
baglidir.
21. -Ayrilan protein zonlarinin diskoid seklinden dolayi bu metod bazen disk elektroforezi olarak da tanimlanmaktadir.
Avantajlari:
-Termostabil, saydam, kimyasal olarak inerttir.
- Genis por byklgne sahiptir.
Ykszdr.
Dezavantaji:
Kanserojeniktir.
22. SDS-poliakrilamid jel elektroforezi - Bu elektroforez tipinde -mercaptoethanol kullanilir ama disulfid kprlerini indirgemektir.
- -mercaptoethanol & SDS, numune ile 5 dakika kaynatilir.
- SDS: Kuvvetli deterjan etki ile proteinleri denatre eder. SDS proteinlerin yzeyini kaplar ve proteinlerin hidrofobik blgelerine baglanir .
- Separasyon molekler byklge gre gereklesir.
- Genellikle proteinlerin molekl agirligi ve proteinlerin saflik tayininde kullanilir.
24. Kapiller elektroforez - Sistem ters cevrilmis U seklinde duran ve uclari tampon dolu tuplere batmis durumda iken yksek gerilim uygulanan bir borudan olusur.
- Dis yzeyi; ya bir sivi kilifi yada soguk hava akimi ile sogutularak isinma sorunu ortadan tamamen kalkar.
- ok kirilgan olan bu kapillerin kirilmasini nlemek icin zeri poliimid tabakasi ile kaplanmistir.
- Poliimid tabakasinin detektor nune gelen kismi ya soyularak yada yakilarak bir pencere ailir.
- Bu pencere, spektrofotometre kuveti grevi grr.
- Elektroforezle ayrilan molekller bu pencereden geerken isigi absorbe ederler.
- Absorbe edilen isik detektr tarafindan saptanir.
- Bilgisayar sistemi araciligi ile absorbsiyon pikleri ekrana verilir .
26. Immnoelektroforez - Ilk kez 1953 yilinda Grabar ve Williams isimli iki bilim adami, jel elektroforezi sonrasi immn diffzyon uygulamislardir.
Immnelektroforez ile bir ok spesifik protein gsterilebilir:
Prealbumin, albumin, a1- asit glukoprotein, a1-antitripsin, tiroid baglayan globulin, a1-kimotripsin, a2-HS glukoprotein, a2-makroglobulin, seruloplazmin, haptoglobin, antitrombin III, C1 esteraz inhibitr, hemopeksin, lipoprotein, transferrin, C3, C4, C5, properdin faktr B, plazminojen, IgA, IgM, IgG.
- Bu yntem bu gn klinik laboratuarlarda, immnglobulinlerin
gsterilmesinde yaygin olarak kullanilmaktadir.
Immunelektroforez iin agaroz jel kullanilir.
Bu yntemin prensibi; serum proteinlerinin elektroforetik ayrimindan sonra, aranan proteine karsi antiserum
ekleyerek antijen-antikor presipitatlarinin gsterilmesidir.
27. Diger elektroforez yntemleri - iki ynl Jel Elektroforez
- Izoelektrik Odaklanma
- OFarrell Metodu
- Pulse Field Jel Elektroforez (PFGE)
- Preparative Gel electroforezi
- Protein Elektroforezi
- Serum Protein Elektroforez
- Hemoglobin Elektroforezi
- Lipoprotein Elektroforezi
28. Kullanim yerleri Saflastirma
Saflik kontrol
Molekl agirligi saptama
Kalitsal veya kalitsal olmayan hastaliklarin belirlenmesi
Enzim izozimlerinin saptanmasi (tanisal amali, populasyon alismasi iin,adli tipta)
Immnolojik ve molekler biyoloji
29.
THE END