html5-img
1 / 44

Likvor v diferenciální diagnostice roztroušené sklerózy

Likvor v diferenciální diagnostice roztroušené sklerózy. David Zeman 1,2 , Ludmila Nováčková 1 1 ÚKB a 2 Neurologická klinika FN Ostrava. Obecné schéma likvorové diagnostiky. STATIMOVÝ PROGRAM: vzhled před centrif., po centrifugaci počet elementů a ery ve FR Hb (kvalit.), Pandy

miranda
Télécharger la présentation

Likvor v diferenciální diagnostice roztroušené sklerózy

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Likvor v diferenciální diagnostice roztroušené sklerózy David Zeman1,2, Ludmila Nováčková1 1ÚKB a 2Neurologická klinika FN Ostrava

  2. Obecné schéma likvorové diagnostiky

  3. STATIMOVÝ PROGRAM: vzhled před centrif., po centrifugaci počet elementů a ery ve FR Hb (kvalit.), Pandy CB, glukóza, laktát cytologický preparát IMUNOCHEMICKÁ VYŠ. - základní panel: Q-Alb (Alb-CSF/Alb-S) Q-IgG, Q-IgM, Q-IgA, výpočet lokální (intrathékální) syntézy oligoklonální IgG (izoelektrická fokusace se specifickou detekcí IgG) Přehled metod likvorové diagnostiky

  4. Likvorová diagnostika u RS: „pozitivní CSF“ v diagnostických kritériích • Poser a kol. 1983: „laboratorní podpora“ dg. RS = průkaz oligoklon. IgG pásů v likvoru nebo zvýšené syntézy IgG v CNS (IgG index); „OCB nesmí být v séru a sérová koncentrace IgG musí být normální“ • McDonald a kol. 2001: oligoklon. IgG pásy v moku nepřítomné v séru, detekované nejlépe metodou IEF, a/nebo zvýšený IgG index; lymfocytární pleocytóza <50 buněk/μl; pozitivní CSF obligátní pro podporu diagnózy primárně progresívní RS • Polman a kol. 2005: pro diagnózu primárně progresívní RS nemusí být pozitivní CSF, je-li pozitivní MR mozku (9 T2 lézí nebo  4 léze + pozitivní VEP) i MR míchy (2 fokální T2 léze) • Podle všech 3 uvedených diagnostických kritérií je vyšetření CSF pro diagnózu RS potřebné pouze v určitých vyjmenovaných situacích

  5. Klinický průkaz  2 lézí MR – 3 ze 4 kritérií: 1 Gd-enhancující léze nebo 9 T2-hyperintenzních lézí 1 infratentoriální léze 1 juxtakortikální léze 3 periventrikulární léze Při pozitivním likvoru je kritérium naplněno, jsou-li na MR 2 ložiska kompatibilní s diagnózou RS !!! Diagnostická kritéria RS: rozprostřenost v prostoru

  6. Diagnostická kritéria primárně progresívní RS • Progrese nemoci 1 rok a zároveň 2 z následujících 3 kritérií: • Pozitivní MR mozku (9 T2 lézí nebo 4 T2 léze a zároveň pozitivní VEP) • Pozitivní MR míchy (2 fokální T2 léze) • Pozitivní likvor

  7. Praxe v ČR: každý pacient se susp. RS má vyšetřen likvor – i v případech, kdy to mezinárodní diagnostická kritéria nevyžadují Podobný postoj v SRN – podle směrnic DGN (www.dgn.org) „vyšetření likvoru hraje v diagnostice RS nadále ústřední roli, zejm. slouží k odlišení od infekčních nemocí (např. borreliózy), lokální syntéza IgG a IgM poukazuje na chronický zánětlivý proces a má i význam prognostický“ ROZSAH VYŠETŘENÍ: Směrnice DGN (www.dgn.org): cytologie, Q-Alb, Q-IgG, Q-IgM, Q-IgA, oligoklonální IgG, AI pro neurotropní viry (MRZ reakce), při klinickém podezření též AI pro borrelie Směrnice DGLN (www.dgln.de): počet buněk a jejich diferenciace, CB, Q-Alb, ith. syntéza IgG, IgM, IgA, oligoklon. pásy, AI (M, R, Z, borrelie) jsou obligátní testy; laktát a Q-glukosy jsou fakultativní testy Likvorová diagnostika RS

  8. Doporučení pro likvorovou diagnostiku RS • Andersson a kol. 1994: CSF in the diagnosis of MS: a consensus report: komplexní zpracování problematiky, pro detekci intrathék. syntézy IgG doporučena IEF se specifickou detekcí IgG • Freedman et al. 2005: Recommended standard of CSF analysis in the diagnosis of MS: nejdůležitějším vyšetřením je detekce oligoklonálního IgG metodou IEF s následnou imunodetekcí (blotting nebo fixace) • Franciotta et al. 2005: Consensus recommendations of the Italian Association for Neuroimmunology for immunochemical CSF examination • Link, Huang 2006: Oligoclonal bands in multiple sclerosis cerebrospinal fluid: An update on methodology and clinical usefulness

  9. Počet buněk: - v 60 % mírně zvýšen (4-50/μl) - vzácně (cca 1 %) mezi 50-100/ μl - hodnoty nad 100/μl diagnózu RS zpochybňují! (neuroinfekce) Diferenciální cytologie: - většinou lymfocytární reakce, <10 % aktivovaných B-lymfocytů a plazmocytů - vzácněji monocytární reakce nebo (10-15 %) normální cytologický nález -nikdy významné zastoupení segmentů Likvorová diagnostika RS - cytologie

  10. Cytologické nálezy u RS

  11. Cytologické nálezy u RS II.lipofág (vlevo), pěnitá buňka (vpravo)

  12. Celková bílkovina: normální nebo mírně zvýšená (<0,80 g/l) Q-Albumin (CSF/S)*103: - v 70-80 % normální - vzácněji mírně zvýšen (<10) - vzácně mezi 10 – 20 Glukosa (CSF/S) a laktát: pro dg. RS fakultativní parametry (ale mohou být užitečné v diff. dg.) Intrathékální syntéza imunoglobulinů: - IgG (kvantitativně cca v 70-75 % případů, kvalitativně v 90 – 98 % případů) - IgM (pravděpodobnost agresívnějšího průběhu nemoci u RR a SP formy) - IgA (<10 % případů; je-li dominantní  pochybnosti o diagnóze RS) Likvorová diagnostika RS – biochemie a imunochemie

  13. 50 let oligoklonálního IgGHolmoy T. Eur Neurol 2009, 62: 311-315 • CSF pacienta s SSPE: subfrakce 1 - 4 (Karcher et al. 1959) Elfo v agarovém gelu

  14. 50 let oligoklonálního IgGHolmoy T. Eur Neurol 2009, 62: 311 - 315 • První jasný průkaz oligoklonálního IgG v CSF (Lowenthal et al. 1960) – elfo v agarovém gelu • Pozitivní oligoklonální pásy u RS  v patogenezi RS se uplatňují klonálně expandované lymfocyty • 1 = RS; 2 = SSPE; 3 = normální kontrola; 4 = neurosyfilis; 5 = afr. trypanosomiáza

  15. Oligoklonální IgG (vlevo) a fKLC(vpravo) u pacienta s SSPEvlastní výroba - ÚKBLD 1. LF UK Praha 2002 • AFINITNÍ IMUNOBLOTTING • IgG: Sw anti-Hu IgG antisérum pro potah a Sw anti-Hu IgG: HRP (Sevapharma) pro detekci • fKLC: metoda s kombinací anti-Hu fKLC polyklonální Ab pro potah a polyklonální anti-Hu(f+b)KLC:HRP (DAKO) pro detekci (Lamers et al., 1995): problém křížové reaktivity

  16. IgG: „Quantity versus quality“ Hodnocení: Typ 2 – intrathékální syntéza. Komentář:V moku 3 pásy v perineutr. oblasti bez sérového korelátu. Proká-zána lokální produkce oligoklon. IgG.

  17. Oligoklonální IgG dnes IEF + imunofixace v gelu (SEBIA) • Pozice 4: Dívka 15 let, dg: inoperabilní míšní nádor • CSF: 44/3 elem, cytol.prep. - 90 % lymfo, 2 % plazmo, 8 % mono; CB 0,28 g/l, glukosa 3,3 mmol/l, Q-Alb*103 4,00, ith. syntéza IgG výpočtem neprokázána, ale 11 OCB v moku bez sérového korelátu • Revize dg: RS

  18. OLIGOKLONÁLNÍ IgG5 typů podle mezinárodní klasifikace • TYP 1: normální (negativní) nález – žádné pásy v moku ani v séru • TYP 2: lokální (intrathékální) syntéza - 2 pásy v moku, žádné pásy v séru • TYP 3: lokální (intrathékální) syntéza + „systémová“ syntéza: 2 pásy v moku, které nejsou v séru + společné pásy v moku i v séru • TYP 4: „systémová“ syntéza, pasívní přestup sérového oligoklonálního IgG do moku; žádná intrathékální syntéza!! – společné pásy v moku a séru • TYP 5: obraz paraproteinu – společné pásy v moku a séru (blízko sebe, intenzita stoupá směrem ke katodě)

  19. Oligoklonální IgG – „hraniční“ nálezy • 1 pás v moku  typ 1 - není intrathékální syntéza (doporučení DGLN) • Z toho nepřímo vyplývá: 1 společný pás v moku i v séru  typ 1 (není OLIGOklonalita) • Ale: 1 společný pás v moku i v séru + 1 pás v likvoru bez korelátu v séru  typ 1 nebo typ 4 ? • Migrační mikroheterogenita: typ 1 nebo typ 4 ? (v žádném případě nejde o intrathékální syntézu)

  20. Oligoklonální IgG - příklady

  21. Příklad likvorového nálezu u RS • 32/3 elem • CB 0,246 g/l • CSF-albumin 112 mg/l • CSF-IgG 112 mg/l • S-albumin 39 g/l • S-IgG 11,2 g/l • Q-Alb 2,87*10-3 • Q-IgG 10*10-3 • oligoklonální IgG: 18 pásů v moku, 0 v séru

  22. Příklad likvorového nálezu u RS: cytologie • lymfocyty 77 %, plazmocyty 4 %, monocyty 19 % • Nečetné aktivované lymfocyty a monocyty, ojedinělé mírně atypické lymfocyty v.s. v rámci zánětlivé aktivace • Závěr: Lymfocytární pleocytóza s plazmocytární reakcí – obraz nehnisavého zánětu, výtečně kompatibilní i s uvedenou dg. RS.

  23. Oligoklonální IgG – dynamika nálezu: případ 1 • Vlevo: 17. 9. 2009: 7 pásů v moku, 5 v séru - typ 3 • Vpravo: 14. 5. 2010: 7 pásů v moku, 4 v séru - typ 3 • Neměnná poloha a počet pásů podporují dg. RS • … ale POZOR! Lze srovnávat pouze stejnou metodu na stejném pracovišti !!!

  24. MRZ reakce: protilátky proti virům spalniček (Measles), zarděnek (Rubella) a varicella Zoster s výpočtem lokální protilátkové syntézy – protilátkového indexu (antibody index – AI): průkaz polyspecifické imunitní odpovědi – RS, systémová autoimunita s postižením CNS (zde diff. dg.: autoprotilátky v séru), větší specificita pro RS než u oligoklonálního IgG (negat. u chron. neuroinfekcí, NMO, PND) U pacientů s RS jsou zvýšené hodnoty AI: M 78 %, R 65 %, Z 55 %; MRZ > 90 % (pozitivita protilátek k 1-3 antigenům) V průběhu RS se může pozitivita objevit nově a zvýšený M-AI je spojen s rychlejší progresí nemoci (Petereit, Reske 2005) M a R protilátky významnější pro diagnostiku RS než Z (Brettschneider a kol. 2009) Intrathék. syntéza antiborre- liových protilátek (AI): dif. dg. význam (může však být i v rámci polyspecifické imunitní odpovědi u RS) Likvorová diagnostika RS – specifické protilátky, MRZ reakce

  25. Co potřebujeme vědět pro výpočet intrathékální syntézy Ig • Kvocient albuminu Q-Alb = CSF-Alb/S-Alb • Kvocient IgG, IgA, IgM (obecně každého plazmatického proteinu) Q-IgX = CSF-IgX/S-IgX • IgG, IgA, IgM index = Q-IgX/Q-Alb • Historické metody výpočtu intrathékální syntézy Ig: a) extendovaný Ig index (Öhman): Q-IgX/(Q-Alb)a b) Tourtellotův vzorec: [(CSF-IgG – (S-IgG/615))-(CSF-Alb – (S-Alb/291))*(S-IgG/S-Alb)*0,43)]*5 = intrathékální syntéza IgG v mg/den • Q-Alb > Q-IgG > Q-IgA > Q-IgM ; obrácení některé z těchto nerovností svědčí pro i.th. syntézu

  26. Výpočet intrathékální syntézy Ig – Reiberova hyperbolická funkce

  27. Parametry Reiberovy hyperbolické funkce

  28. Výpočet intrathékální syntézy Ig • IgXLOC = (Q-IgX – QLim-IgX) x S-Ig [mg/l ] • IgXIF = 1 – (QLim-IgX/Q-IgX) x 100 [%] • Podle intrathékální frakce IgXIF posuzujeme dominanci intrathékální Ig syntézy v jednotlivých třídách (např. ith. IgM = 80%, ith. IgG = 25%: IgMIF > IgGIF)

  29. Protilátkový index (AI)(Reiber a Lange 1991) • AI = Q-Ig spec/Q-Ig, je-li Q-IgQ-lim • AI = Q-Ig spec/Q-lim, je-li Q-Ig>Q-lim • AI  1.5 svědčí pro lokální (intrathékální) syntézu specifických protilátek

  30. Specifické oligoklonální IgG • IEF  afinitní imunoblotting na membránu inkubovanou s relevantním antigenem (neuroinfekce – HSV, M. tuberculosis, borrelie, …; RS – řada perspektivních Ag-ů /neurotropní viry, složky myelinu, … /, přesto dodnes neznáme antigenní specifitu většiny lokálně syntezovaného IgG) • Postup: 1. Potah membrány roztokem relevantního antigenu (6-24 hod), 2. Blokování volných vazebných míst (30-90 min – v průběhu IEF), 3. Blotting (30-60 min), (4. fixace 0,1% - 0,25% glutardialdehydem), 5. Inkubace membrány se značenou protilátkou ( 60 min), 6. Detekce

  31. Oligoklonální IgG (vlevo) a oligoklonální antiborreliové IgG (vpravo) nahoře: 1. vzorek (9/2007) dole: 2. vzorek (8/2008)

  32. Nehnisavé neuroinfekce I. Klíšťová meningoencefalitida 1. LP (13. 6. 2000): CSF lehce zkal., po centrif. čb 906/3 elem, 80/3 ery, CB 0.91 g/l, glukóza 4.25 mmol/l, laktát 1.95 mmol/l Kontrolní LP (10. 7. 2000): CSF čb, 167/3 elem, 5/3 ery, CB 0.55 g/l, glukóza 2.9 mmol/l, Q-Alb 7.2, i.th. IgG 43% (38 mg/l), i.th. IgM 94% (91 mg/l), i.th. IgA 0%

  33. Nehnisavé neuroinfekce II. • Muž 64 let, meningo- polyradikuloneuritický sy. • CSF: čb, 728/3 elem, 2/3 ery, cytologie: Ly 88%, Plb 7%, Mo 4.5%, Neu 0.5% CB 1.26 g/l, glukóza 4.2 mmol/l, laktát 2.3 mmol/l, Q-Alb 19.2, i.th. IgG 30% (78 mg/l), i.th. IgM 63% (16 mg/l), i.th. IgA 0%, fLC-index 7, oligo-f LC pozitivní.

  34. Diferenciální diagnostikaObraz nehnisavého zánětu • Roztroušená skleróza: pleocytóza mírného stupně, popř. chybí, CB a Q-Alb zprav. norm., i.th. syntéza IgG, popř. + IgM) • Systémová autoimunitní onemocnění s postižením CNS • Jiná „chronická zánětlivá onemocnění autoimunitního typu“ (NMO, PND) • Nehnisavá neuroinfekce • Reakce na parameningeální zánětlivý proces (cave spondylodiscitis, sinusitis, otitis!) • Mozkový absces (i.th. syntéza IgA !!) • Neurotuberkulóza (CB a Q-Alb , laktát , Q-glukózy , i.th. syntéza IgA !! ; PCR!) • Neurobrucelóza

  35. Diferenciální diagnostikanehnisavý zánět x meningeosis lymphomatosa/leukaemica

  36. Popis cytologického preparátu Výsledky jednotlivých stanovení, výpočet Q-Alb, Q-Ig, intrathékální syntézy Ig v % a v mg/l, AI Výsledek vyšetření oligoklon. IgG Diferenciálně – diagnostický rozbor: normální nález nespecifické změny zánětlivý proces (hnisavý/nehnisavý, akutní/chronický, „infekční“/autoimunitní) nádorové postižení krvácení do likvor. cest Závěr likvorového vyšetření

  37. Kvantifikace v CSF: řádové rozpory v publikovaných studiích (pro fLLC až o tři řády!!), ale shoda o významně zvýšených hodnotách fKLC u RS 1) latex-enhanced nefelometrie (FreeLiteTM) – problematické v normálních likvorech 2) ELISA a) BioVendor – sendvičová metoda b) „home-made“ kompetitivní nebo sendvičové metody fLC v moči: slibný marker aktivity nemoci (Mehta et al. 1991, 1998) – opakovaná vyšetření; nemají význam diagnostický Oligoklonální fLC: detekce v párovém vzorku likvoru a séra a srovnání Srovnání obou přístupů: Diagnostický význam pro fKLC, nejasný pro fLLC Nelze s jistotou deklarovat přednost detekce oligoklonality oproti kvantifikaci Perspektivy I.: volné lehké řetězce (fLC)

  38. Oligoklonální IgG – negativní, typ 1 (nahoře),fKLC (dole vlevo) i fLLC (vpravo) pozitivní v CSFPacient s akutní nehnisavou neuroinfekcí

  39. Perspektivy II: Oligoklonální IgM • Prognostický význam u RS (RR, SP) - pozitivita implikuje agresivnější průběh nemoci • Prognostický význam má patrně lokální syntéza IgM proti myelinovým lipidům – fosfatidylcholinu a/nebo sfingomyelinu (RR-RS 30 %, SP-RS 60 % x PP-RS 0 %) • Metodicky obtížné, nicméně metoda detekce celkového i specifického oligoklonálního IgM byla publikována (Villar et al. 2001, 2005)

  40. Oligoklonální IgMVillar et al., J Immunol Methods 2001,258:151-155 • 50 mM DTT 30 min, RT • IEF, imunoblotting • Chromogenní detekce (BCIP/NBT) s protilátkou značenou ALP • A – OCB patrné až do koncentrace 0,025 mg/l (0,125 ng/pozici) • B – žádná křížová reaktivita s IgG

  41. Oligoklonální IgMSchneider et al., Eur J Neurol 2007, 14: 907-911 • Afinitní imunoblotting, chemiluminiscenční detekce • Vzorky „treated with dithiothreitol to facilitate IgM migration“ • 2 páry CSF + S vlevo pozitivní, 2 páry vpravo negativní • Ve všech vzorcích pozorováno „a slight separation of IgM“ • Nekorelují s rizikem relapsu u pacientů s CIS

  42. Oligoklonální IgM se specifitou proti myelinovým lipidůmVillar et al., J Clin Invest 2005, 115: 187-195

  43. ZÁVĚR • Nejdůležitějším vyšetřením v likvorové diagnostice RS je detekce oligoklonálního IgG • Zejména z diferenciálně-diagnostických důvodů je nezbytné též stanovení počtu buněk a jejich diferenciace (lépe v trvalém preparátu), Q-Alb (stav H-L bariéry), Q-IgG, Q-IgM, Q-IgA a AI (M, R, Z, popř. borrelie, HSV) k posouzení intrathékální syntézy „celkových“ i specifických protilátek • Perspektivními testy jsou stanovení/detekce volných lehkých řetězců, oligoklonální IgM a různé specifické protilátky (AI, oligoklonální specif. protilátky) • V blízké budoucnosti lze čekat upřednostnění detekce oligoklonálních IgM, IgA a fLC pásů před výpočty intrathékální syntézy

More Related