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２５年度環境応答生理学第２回　（４ / ２４）

２５年度環境応答生理学第２回　（４ / ２４）. 水ストレス環境と水輸送系その２（ アクアポリンの多様な機能 、最新研究成果の紹介） 塩ストレス環境とイオン輸送系その１（理論的側面と分子機構） ＜ GMO について＞. 腎臓（集合管）における水再吸収を担うアクアポリン（ AQP2 ）. ヒトにおけるアクアポリン（ＡＱＰ）分子種の分布と AQP2 の働き. 「みずみずしい体のしくみ」（クバプロ） 2005 年　第１９回「大学と科学」公開シンポジウム講演収録集. 植物のアクアポリン　その機能と調節. 表皮. 皮層. 内皮. H 2 O.

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２５年度環境応答生理学第２回　（４ / ２４）

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  1. ２５年度環境応答生理学第２回　（４/２４）２５年度環境応答生理学第２回　（４/２４） • 水ストレス環境と水輸送系その２（アクアポリンの多様な機能、最新研究成果の紹介） • 塩ストレス環境とイオン輸送系その１（理論的側面と分子機構） • ＜GMOについて＞

  2. 腎臓（集合管）における水再吸収を担うアクアポリン（AQP2）腎臓（集合管）における水再吸収を担うアクアポリン（AQP2） ヒトにおけるアクアポリン（ＡＱＰ）分子種の分布とAQP2の働き 「みずみずしい体のしくみ」（クバプロ） 2005年　第１９回「大学と科学」公開シンポジウム講演収録集

  3. 植物のアクアポリン　その機能と調節 表皮 皮層 内皮 H2O アフリカツメガエル卵母細胞機能発現系 共発現（相互作用） 道管 <Apoplastic or Symplastic > ２型ホモテトラマー Root hair １型と２型のヘテロテトラマー （InjectionしたRNA量） 植物組織（オオムギ根） 主にPIP2s （HvPIP2;2) 主にPIP1s PIP1とPIP2が共発現 分子間相互作用による活性制御を組織ごとに使い分けている可能性

  4. 浸透圧ストレス（乾燥および塩ストレス）への対応浸透圧ストレス（乾燥および塩ストレス）への対応

  5. 脱水を防ぐには・・・・水透過性の制御（抑制）＋浸透調節脱水を防ぐには・・・・水透過性の制御（抑制）＋浸透調節 ＜早い反応＞ • リン酸化によるアクアポリンの活性化 • 脱リン酸化によるアクアポリンの不活性化 Kjellbom et al.4:308-14(1999) ＜別の早い反応＞ アクアポリンを細胞内に取り込んでしまう！ Membrane trafficking / Internalization

  6. Salt stress（塩ストレス） H2O PM（原形質膜） aquaporin Osmotic adjustment（浸透調節） Transientadaptation（一過的適応） オオムギPIP10遺伝子の発現 　（360 mM mannitol) 脱水抑制＝水透過性抑制 まず　活性抑制 　次に　発現抑制 相対mRNA量

  7. Salt stress Over- expression H2O PM aquaporin Osmotic adjustment Transient adaptation

  8. アクアポリン過剰発現体 (over-expression) Katsuhara et al. Plant Cell Physiol. (2003)44:1378-1383

  9. WT6322 FW(g) RGR(%) shoot/root wt 26±7 148 2.4 (100%) 6322 30±14 137 3.5 (146%) Transgenic rice withHvPIP2;1 通常の生育条件では・・・ • 地上部の見た目は大きく違わない。 • 根が小さい ┌ T2 rice root ┐ wt barley 6322 6360 HvPIP2;1の タンパク量 （Westernblot) Lpr2.0±0.2 (2.1±0.2) 2.8±0.1 ND (10-13 m s-1 Pa-1)

  10. 根から地上部へ供給される水の量Ｊｖ 根の水透過性 （単位面積あたり） × 根の総面積 （単位時間あたり、単位圧力あたり） タバコの場合 ↑ （一定） ↑ ↑ ↓ Ｊｖ 　　 （一定） （地上部の生長量） shoot/root イネの実験 Aharon ら、Plant cell15：439, 2003

  11. 　根の水透過性（Root hydraulic conductivity：Lpr)とアクアポリン Pressure chamber（プレッシャーチェンバー） Sap flow (Jv) Jv /A = Lpr (ψp - Y) A : total root surface area ψp: applied pressure Y : Yielding pressure J = Lp×（ DPhydro - s×DPosm） s　：反発係数　(0～1；完全な半透膜では1） J = Lp× DPhydro - Lp× s×Dposm DPhydro ＝the applied hydrostatic pressure Ph-app • (because Phydro of plants is zero) DPosmis constant during measurements (internal and external osmotic pressure is constant) J = Lp× P h-app - Constant Pressure

  12. 　根の水透過性（Root hydraulic conductivity：Lpr)とアクアポリン Pressure chamber（プレッシャーチェンバー） Sap flow (Jv) Jv /A = Lpr (ψp - Y) A : total root surface area ψp: applied pressure Y : Yielding pressure Control (No stress) (Barley (Haruna-nijo)) Pressure 0.8 リン酸化阻害剤(Staurosporin:St)の影響 (PCP 52:663, 2011) 0.6 LPr [10-6 ms-1 MPa-1] 0.4 0.2 0

  13. 耐塩性の異なるオオムギ2品種におけるLprの塩ストレス応答耐塩性の異なるオオムギ2品種におけるLprの塩ストレス応答 (100 mM or 200 mM NaCl for 1h ) 根の水透過性 耐塩性強 (salt tolerance) ストレス 　速やかなLprの低下 　脱水を防ぐ！ 　ストレス耐性 耐塩性弱 (salt sensitive)

  14. オオムギBarley Lpr after 100 mM NaCl (Time course) Salt tolerance: low Salt tolerance: middle Salt tolerance: high イネRice (Nipponbare) Lpr after 100 mM NaCl Less reduction of Lpr

  15. 塩ストレス/浸透圧ストレス１時間　脱リン酸化とエンドサイトーシス塩ストレス/浸透圧ストレス１時間　脱リン酸化とエンドサイトーシス Lpr of Haruna-nijo after salt (100 mM NaCl) or osmotic (177 mM sorbitol) stress P アクアポリン P アクアポリン P アクアポリン (mM) (mM) (μM) (μM) (mM) (mM) (μM) Protein-phosphatase inhibitor (Okadaic acid; OA) and enodcytosis inhibitor (wortmannin: wm) inhibit salt-induce Lpr reduction at 1 h after stress

  16. 塩ストレス/浸透圧ストレス４時間　エキソサイトーシス塩ストレス/浸透圧ストレス４時間　エキソサイトーシス Lpr of Haruna-nijo after salt (100 mM NaCl) or osmotic (177 mM sorbitol) stress P アクアポリン P アクアポリン Exodcytosis inhibitor (brefeldin A : BFA ) inhibits temporal recovery of Lpr at 4 h after stresds

  17. 塩ストレス/浸透圧ストレス４時間以降　タンパク分解系塩ストレス/浸透圧ストレス４時間以降　タンパク分解系 Lpr of Haruna-nijo after salt (100 mM NaCl) or osmotic (177 mM sorbitol) stress Proteasome inhibitor (MG132 ) inhibits reduction of Lpr after stress > 4 h

  18. Salinity (Osmotic) stress Non-stress Osmotic stress signal H2O PIP aquaporin MG132 P P BFA WM OA （<4h） Severe stress Transient Pool （>200mM NaCl） Mild stress （>4h） Activate Protein degradation mRNA & Protein degradation

  19. Stimulus-induced downregulation of root water transport involves reactive oxygen species-activated cell signalling and plasma membrane intrinsic protein internalization. The Plant Journal (2008) 56, 207–218 Boursiacet al. 塩ストレス誘導性Lpr抑制 ↑ PIPinternalization ↑ 活性酸素 ↑ 塩ストレス Fluorescence recovery after photobleaching reveals high cycling dynamics of plasma membrane aquaporins in Arabidopsis roots under salt stress. The Plant Journal (2012) 69, 894–905 Luu et al.

  20. 細胞質に蓄積される 特殊な有機物質　→ 適合溶質（compatible solute）とよばれる浸透圧を上げる シャペロン活性 スカベンジャー活性 ベタインとは、本来はアミノ酸のアミノ基に3つのメチル基が付いた化合物の総称。 H3N+- →　(CH3)3N+- もっとも存在量の多いグリシンベタイン（＝トリメチルグリシン）を、単にベタインと呼ぶことも多い。

  21. タバコ葉の例 （プロリン蓄積） グリシンベタインの合成系 塩ストレス誘導性 イネ 左： 150 mM NaCl 右： 150 mM NaCl + 5mM betaine aldelyde

  22. アクアポリンが関係するさまざまな現象 Nature Cell Biology 14(10), 991-998 (2012) 背景 • アクアポリンは根の水透過性を決める • 根の水吸収は根形・根量（今回は側根に注目）に依存する • 側根形成にオーキシンが関与する では、アクアポリン、オーキシン、側根の関係は？ Nature 446, 621-622(2007) Auxin response factor (ARF) proteins function as transcription factors controlling auxin-responsive genes. ARF7 plays a key role during lateral root formation and emergence. arf7: loss-of-functionmutant ARF7

  23. 重力刺激で側根が出る 重力刺激でPIP発現変化 オーキシン処理でPIP発現変化 AtPIPsの発現量

  24. Lpr-h: Root hydraulic conductivity (root pressure chamber) オーキシン処理後のPIP2;1の遺伝子発現とタンパク量、水透過性 Lpr-o: Root osmotic conductivity (natural sap exudation) Lpcell: Cell hydraulic conductivity (cell pressure probe) 膨圧

  25. Lpr-h: Root hydraulic conductivity (root pressure chamber) Lpr-o: Root osmotic conductivity (natural sap exudation) Lpcell: Cell hydraulic conductivity (cell pressure probe) T1/2,Turgor, Ep (1 mM IAA, 18h)

  26. オーキシン蓄積部位 模式図 proPIP2;1:GUS (青色GUS染色で発現部位特定) 融合蛍光タンパク(ピンク） でタンパク発現部位特定 proPIP2;1:PIP2;1:mCERRY (e,f) オーキシン処理 (g) PCIB (パラクロロイソ酪酸） アンチオーキシン オーキシンの作用を阻害する

  27. 重力刺激で側根形成（アクアポリンが関与）

  28. 適正量の水流入（＝適正なPIP量/活性）が必要適正量の水流入（＝適正なPIP量/活性）が必要

  29. 開花制御　 低温→高温で開花 花の細胞（特に花下部の細胞）が吸水 原形質型アクアポリン・・・恒常的発現 低温→高温でアクアポリンのリン酸化 （リン酸化されて、水輸送活性上昇） アクアポリンが関係するさまざまな現象 (チューリップの場合） 開花度 含3H2O量 （PCP45：608, 2004) （オートラジオグラフ (32P) マイクロソーム　原形質膜　液胞膜 （抗リン酸化セリン抗体) ダイマー モノマー アフリカツメガエル卵母細胞内での水輸送活性測定 （PCP49：1196, 2008)

  30. 花弁におけるPIP2の発現抑制 アサガオInMYB1上流 1 kb In MYB1 gene 「花弁特異的プロモーター」 　 特願2008-264646 　白武勝裕，森本玲奈， 　 飯田滋，星野敦，森田将裕 形質転換体 ３系統，３個体 PIP2 K/D 追加で 形質転換体 作出中 InMYB1 PIP2 PIP2 花弁特異的に発現抑制 （PIP2をRNAiで抑制） 13 WT

  31. 貧栄養（植物栄養の不足）の場合(Carvajalら、他　Planta 199:372, 1996）　 生育条件 根のアクアポリン発現量が減少　 ↓ 根の水透過性/吸水量減少 ↓ 地上部の成長抑制 Hg(水銀）イオン：多くのアクアポリンを阻害

  32. 葉の就眠運動　 (Moshelionら　Plant Cell 14:727. 2002） 朝（昼）：アクアポリンの活性上昇 　→　細胞の吸水増加　→　葉が開く 夜間：アクアポリンの活性低下 　→　細胞が脱水　→　葉が閉じる

  33. (Tournaire-Rouxら、nature 425:393, 2003) 湛水による吸水阻害　 アフリカツメガエル卵母細胞での水輸送活性測定 • 洪水などによる湛水（水びたし） • 根が酸素不足 • ATP欠乏 • H+-ATPase活性低下 • 細胞質の酸性化 • 細胞膜アクアポリンの不活化 ・・・　原因はH197 pH６から７の範囲でのアミノ酸の荷電状態 H (ヒスチジン)：　pH依存で解離状態変化　＜pH６でプラス　pH７で中性＞ D（アスパラギン酸）：マイナス荷電　　 A(アラニン)：中性 K（リジン）：プラス荷電

  34. 植物のイオン輸送系（概説） • 長距離輸送　　根→道管→茎・葉Long distance transport Root → Xylem → Stem/Leaf（部位ごとに輸送系の使い分けがある） （糖など同化産物の移動）　　（イオンは師管からの逆送もある） 　　葉緑体→葉の細胞→師管→根・生殖器官　（Source）　　　　 （Sink） • 環境変動（不足と過剰）に対応 (excess and deficiency)

  35. 多種多様な輸送系（とその遺伝子）の存在 Various transport systems (and corresponding genes) 208種類 559種類 101種類 • Pump • Transporter • Channel シロイヌナズナの場合 (Arabidopsis) 「植物の膜輸送システム」（秀潤社）より

  36. Detoxification Compartmentation Tolerant（耐性）/sensitive（感受性） determinants and transport system Cell/Individuals • Tolerant？Sensitive？ Tolerant mechanisms: detoxification（無毒化）, compartmentation（区画化）, less absorption（吸収低下）, exclusion（排出）, to be insensitive（非感受化） 標的 Tarｇet Elements （toxic materials） • Sensitive： Originally no tolerant mechanism Inactivation of tolerant mechanism→　Disturbance in metabolism and others (Injory mechanism)

  37. + + + + + + • - - + + + + + + + + + 「電気化学ポテンシャル」(electrochemical potential) とは　「濃度差と電位差の両方を考慮したもの」(including both gradient of concentration and electric field) 輸送の基本　・・・　濃度勾配（濃度差）Movement ・・・ Gradient (Concentration) • - -(minus charge) 10倍の濃度差と、59mVの電位差がつりあうBalance between 10-hold concentration gradient and 59 mV

  38. 電気化学ポテンシャル（の正式） Electrochemical potential (formula) 標準状態の化学ポテンシャル (standard chemical potential)μ* 気体定数 (Gas Constant)R　　絶対温度 (Abs. Temp.)T　　活量 (activity)a 粒子のイオン価 (charge No.)z　　ファラデー定数 (Faraday Const.)F 電位 (electric potential)φ 平衡電位 (Reversal(Equivalent) potential) Em or Erev ネルンストの式:Nernst equation 　膜内外で一価（下図の場合K+）が平衡しているときは・・・ 外側基準 (outer is zero standard) K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ (In case of K+)

  39. ADP + Pi エネルギーを直接使って、電気化学ポテンシャル勾配に逆らって、物質を輸送する (Against electrochemical gradient, using energy) ポンプ (Pump) H+ H+ H+ H+ Example: H+ -ATPase H+ 輸送速度は毎秒１０２個 (102 molecules per sec) ATP H+

  40. H+ Na+ Na+ H+ ある物質X（たいていH＋）の電気化学ポテンシャル勾配を利用して、目的の物質Yを濃度勾配に逆らって輸送する (Using electrochemical gradient of X (H＋in most case), transporting Y against Y’s electrochemical gradient) トランスポーター (Transporter) Na+ H+ H+ H+ H+ Na+ Na+ Example: Na+-H+ -antiporter Na+ Na+ H+ 輸送速度は毎秒１０3個 (103 molecules per sec)

  41. glucose glucose 目的の物質を、電気化学ポテンシャル勾配濃度勾配にしたがって（促進的に）輸送する (Transport X according to its electrochemical gradient) チャネル (channel)一部のトランスポーター　（Some Transporter） K+ glucose K+ K+ K+ K+ • - - - • - - - K+ Example: K+ -channel Example: Glucose transporter 輸送速度は毎秒１０3個 (103 molecules per sec) 輸送速度は毎秒１０8個以上 (108 molecules per sec)

  42. ⋍K+の平衡電位 Em of K+ （動物も植物も） 細胞膜電位 （静止電位）Membrane potential (Resting potential) 細胞膜電位　＝　非起電性成分 Membrane potential non-electrogenic ones （細胞内の非移動性負電荷） intracellular immobile negative charges ＋ 起電性成分（起電性ポンプ） electrogenic ones (electrogenic pump) 動物と植物はここが違う！ Plant unique

  43. Resting potential of living cells 　動物細胞 　　　（起電性ポンプ） 　　　植物細胞 Na+-K+-ATPase　（electrogenic pumps）　H+-ATPase -70 ～ -90 mV -100 ～ -200 mV

  44. For exclusion of [Na+]cyt ・・・ Na+/H+ antiporter Na+の排出(How to low [Na+]cyt) Plant [Na+]out -freeが基本 No Na+-K+-ATPase except sea algae Animal High[Na+]outが基本 Na+-K+-ATPase （例外：海産藻類は、持っている）

  45. 二次輸送システムの基本的な違い Plant Using H+gradient Animal Using Na+ gradient （例外的に）植物細胞にも存在 Some specially in plant cells

  46. 古典的なcell recording 電気生理学的測定 Electrophysiology パッチクランプ Patch Clamp （Single channel recording） （Whole cell recording） 二電極電圧固定測定 （TEVC)in oocyte

  47. Erev （逆転電位） • シングルチャネルレコーディングの例 open ion+ close ↑外向き電流outward current ion+ Outward current ・・・ 　＋ ion efflux （外向きの流れ） 　　または 　－ ion influx（内向きの流れ） ↓内向き電流 inward current

  48. ホールセルレコーディングの例 • Oocyte二電極法の例 µA mV +cAMP cNMP free +cGMP 0.5µA Ｘ トウモロコシプロトプラスト （K+選択性、内向き整流性） 「植物の生化学・分子生物学」より オオムギCNGC2-3のcAMPによる活性化 細胞外液にNa:K=48mM:48mM （信清修士論文より）

  49. カリウムチャネルの分子構造Molecular structure of K channel 放線菌のKcsAチャネル Actinomycetes Kcs （現代科学２００４年１月号より） By Mackinonn ２００３年ノーベル賞

  50. out in K+ Na+ Arabidopsis HKT Na/K 共輸送 symport 「植物の膜輸送システム」 （秀潤社）より

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