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组会汇报

组会汇报. 多杀菌素高产菌株发酵方面 研究现状 汇报人：王美玲 指导导师：卢文玉 -. 分批发酵动力学研究. 刺糖多孢菌的诱变. 发酵工艺优化. 多杀菌素的理化性质. 多杀菌素类化合物是由 刺糖多孢菌 经 有氧发酵 后的 次级代谢产物 。本质上属 大环内酯类 化合物，且没有 抑菌活性 。纯多杀菌素包含6种成分，其中组分A和D的活性最高。 刺糖多孢菌的培养温度约为 24-32℃ ，而产素的最适温度为 28-30℃ 。大规模发酵时应通过通气量和搅拌速度来维持罐内溶解氧在60％以上，最好为 65％以上 。罐内压力为0.034Mpa. 单孢子悬液. 诱变/抗性物质.

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Presentation Transcript

  1. 组会汇报 多杀菌素高产菌株发酵方面 研究现状 汇报人：王美玲 指导导师：卢文玉 -

  2. 分批发酵动力学研究 刺糖多孢菌的诱变 发酵工艺优化 多杀菌素的理化性质

  3. 多杀菌素类化合物是由刺糖多孢菌经有氧发酵后的次级代谢产物。本质上属大环内酯类化合物，且没有抑菌活性。纯多杀菌素包含6种成分，其中组分A和D的活性最高。多杀菌素类化合物是由刺糖多孢菌经有氧发酵后的次级代谢产物。本质上属大环内酯类化合物，且没有抑菌活性。纯多杀菌素包含6种成分，其中组分A和D的活性最高。 • 刺糖多孢菌的培养温度约为24-32℃，而产素的最适温度为28-30℃。大规模发酵时应通过通气量和搅拌速度来维持罐内溶解氧在60％以上，最好为65％以上。罐内压力为0.034Mpa

  4. 单孢子悬液 诱变/抗性物质 复壮 单菌落筛选 培养基优化 初筛 测定稳定性、菌态、性状 高产菌株 复筛 发酵条件优化

  5. 1、诱变突变株： • 菌丝诱变、萌发孢子诱变： 单一诱变和复合诱变 2、抗性突变株： • 多杀菌素抗性突变株：（双层培养法筛选） • 鼠李糖（初级代谢终产物、前体） 3、耐代谢产物结构类似物突变株： • 庆大霉素、红霉素、安普霉素 4、诱变和抗性结合（多重迭代） 5、耐C源分解代谢物阻遏突变 2-脱氧-D-葡萄糖 6、原生质体融合技术

  6. 诱变剂 • 无论化学诱变剂还是物理诱变剂，单独使用很少能收到预期的效果。所以生产中多采用几种诱变剂复合处理、交叉使用的方法 • UV 和氯化锂(LiCl)复合诱变，硫酸二乙酯( D E S ) 诱变，亚硝基胍（N T G） 诱变，D E S和LiCl 复合诱变，60Co g 及137Cs g 诱变 、微波诱变、ＭＮＮＧ • LiCl 本身无诱变作用

  7. 原生质体制备条件和再生研究 • （1）菌丝生长曲线（对数中期） • （2）Gly对再生的影响（干扰细胞壁的形成） • （3）溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶浓度、作用时间、温度的影响（渗透压、稳定剂，Nacl、蔗糖） • （4）原生质体的灭活（热、紫外） • （5）融合： • （种间和种内，与红色糖多孢菌？）（不同分子量和浓度PEG、电融合） • （6）再生培养基的选择（琼脂浓度）

  8. 培养基的优化（发酵和种子培养基） • （1）单一C（N）源、复合C（N）源、有（无）机氮源、微量元素、均与设计实验、正交试验 • （2）响应曲面法 • 单因素试验 P-B试验 SAS软件分析 显著因素 中心组合设计 响应面回归分析 三维图 最优方案 • （3）研究C/N比对菌丝形态和产量的影响（红霉素） • （4）搜集剂（磷钙、沸石）对产量和PH影响 • （铵离子）

  9. 发酵条件优化 • 1、种子液的影响 • 接种量、种龄 • 2、摇瓶发酵条件的优化 • 发酵周期的确定 • 消前pH、摇瓶转速以及摇瓶装量进行正交设计实验 • 变温（4/5d）对产素的影响 • (不)加玻璃珠对生物量和产量的影响 • 3、初始浓度葡萄糖、磷酸盐对菌体和产量的影响，磷酸盐对葡萄糖的利用的影响 • 葡萄糖效应：补糖时间的确定（流加） • 4、补加前体物质的影响：加入时间和量

  10. 5、接种方式的影响：种子（挖块、菌丝、孢子）、发酵（一级和二级种子）（阿维霉素）5、接种方式的影响：种子（挖块、菌丝、孢子）、发酵（一级和二级种子）（阿维霉素） • 6、短链脂肪酸（乙酸、丙酸等）作为缓效碳源加入时间的确定及影响 • 7、DO、OUR、CER、RQ的相关分析 • 8、硝酸铵（促进生长，降低产量）、磷酸二氢钾（调节PH，ATP、磷酸酶）、正丙醇的影响 • 9、混合脂肪酸代替豆油 （螺旋霉素） • 10、流加补料的时间、速率， • 分批补料

  11. 初筛(菌块—TLC法) • 步骤：涂布 培养 浸提 点样 层析 显色 比较 （1、原理：斑点的有无和深浅 （2、验证颜色的深浅与浓度相关（即可行性） （3、展开剂的选择（甲醇/丙酮） （4、检测最低浓度、检测范围的确定 （5、琼脂块的大小的确定 设想：如果培养基中含有在含脂肪，以中性红为检测剂，测定脂肪酶的活性（产量和颜色成正比）

  12. 复筛(HPLC法) • 发酵液的预处理：（油的多少） • 发酵液 离心 弃上清 浸提 离心 微孔滤膜过滤 HPLC • 根据分离度、拖尾因子确定：流动相、流速、进液量，检测波长。

  13. 前体的推测研究 • 根据大环内酯类青霉素为例：（聚酮反应） • 分支氨基酸和植物油分解产生短链脂肪酸 • （1）Asp、Gly、Met、Leu、Val是丙酰CoA的来源。 • 异丁酸、丙酸、乙醇、甲醇、异丙醇、正丙醇、乙酸铵、丙酸钠、丁酸钠、柠檬酸钠形成乙酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙酰CoA等前体 • （2）最佳前体不同浓度和补加时间、补加方式的影响

  14. 提取条件的优化： • 单一溶媒（甲醇、丙酮、乙腈等） • 混合溶媒提取（乙酸乙酯的作用） • 提取时间 • 提取方法（超声波、静置） • 萃取次数 • 被提物的选择取（发酵液、菌体）

  15. 高产菌株生理特性的描述 • 菌落形态、菌丝形态、遗传稳定性、 • 生化特性： • 生物量的测定：干重法，测核酸 还原糖的测定：DNS法 • 可溶性氨基氮的测定：甲醛法/纳氏试剂分光光度法 • 磷酸盐的测定：氯化亚锡分光光度法 • 酸价的测定：游离脂肪酸的含量 • 效价、ＰＨ及其他系数的测定 • 成分Ａ、Ｄ比重

  16. 植物油在大环内酯类抗生素中应用 • （1）疏水性作为缓效碳源避免葡萄糖效应 • （2）为短链脂肪酸的来源，为聚酮类提供前体 • （3）分解为脂肪酸和甘油分别经β-氧化，EMP途径合成乙酰辅酶A • （4）消泡剂 • （5）避免使用黄豆饼粉，粘度大，产泡多 • （6）过量产生脂肪酸使PH下降 • （7）磷酸镁的影响？ • （8）稳定剂对油的利用 • （9）甲基丙二酰CoA羧基转移酶、柠檬酸脱氢酶、脂肪酶活性大小 • （10）脂肪酸种类、饱和程度、添加量和时间的影响

  17. 分批发酵动力学 • 测定生物量、培养液PH、葡萄糖消长、效价的变化趋势利用MATLAB软件对实验数据进行非线性拟合出细胞动力学模型、基质消耗动力学模型、产物生成动力学模型.

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