1 / 91

研究生实验技能培训讲座 －－细胞培养基本知识

研究生实验技能培训讲座 －－细胞培养基本知识. 实验教学中心 侯孟君. 基本概念. 细胞培养技术 细胞系 细胞株 原代培养 传代. 细胞培养 (cell culture) 技术 即是选用各种细胞的 最佳生存条件 对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。. 细胞系. 培养物开始 第一次 传代培养后的细胞 有限细胞系（ Finite Cell Line ） 连续细胞系或无限细胞系（ Infinite Cell Line ） 肿瘤细胞系或株 我国已建细胞系主要为这类细胞。 肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞

morley
Télécharger la présentation

研究生实验技能培训讲座 －－细胞培养基本知识

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 研究生实验技能培训讲座 －－细胞培养基本知识 实验教学中心 侯孟君

  2. 基本概念 • 细胞培养技术 • 细胞系 • 细胞株 • 原代培养 • 传代

  3. 细胞培养(cell culture)技术 即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。

  4. 细胞系 • 培养物开始第一次传代培养后的细胞 • 有限细胞系（Finite Cell Line） • 连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line） • 肿瘤细胞系或株我国已建细胞系主要为这类细胞。 肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞 具有不死性和异体接种致瘤性。

  5. 细胞株 • 用单细胞分离培养增殖形成的具特定生长特性的细胞群 • 再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。

  6. 细胞系或细胞株的命名 以供体患者的姓名命名：HeLa （来源于宫颈癌）以时间地点来命名： CHO 中国仓鼠卵巢细胞 （Chinese Hamster Ovary， ） 宫-743： 宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立 每3天传代，每次接种3×105细胞／ml 以组织来源命名：如BHK(幼地鼠肾细胞) 以临床疾病类型命名： 如BALL-1细胞系(来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞)

  7. 原代培养 • 直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。 • 优点： 组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。 大鼠肝细胞原代培养 1.细胞种类：大鼠原代肝细胞；2.培养的天数：刚分离，未经培养； 细胞状态与特征简述：刚分离时球形透亮，贴壁 后呈不规则。

  8. 传代 • 将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养 • 原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。 HepG2细胞 细胞种类：人肝肿瘤细胞； 培养的天数：传代培养2天； 细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则 贴壁生长，成团聚集。

  9. 传代注意事项 • 接种数量为5×104～8×105个/ml 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 • 培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。 • 如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。

  10. 细胞培养的基本条件 • 无菌条件 • 细胞生长条件 • 细胞检测条件 • 细胞保存条件 • 实验室安全

  11. 细胞培养的无菌环境 • 无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 • （使用前）紫外照射（1小时） • 每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒

  12. 生物安全柜 • 使用前开启柜内紫外灯照射10－30分钟， • 预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。 • 使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。 • 还要定期用福尔马林熏蒸。

  13. 常用培养器皿及清洗消毒 • 玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤 • 新的橡胶制品洗涤方法 0.5M NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5MHCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50℃烤干备用。

  14. 消毒前包装 • 常用的包装材料 牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔

  15. 火焰消毒 • 在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 • 培养瓶 • 滴管、试管、吸管

  16. 细胞培养的实验用品 • 细胞培养瓶 • 25平方厘米，正方斜颈 • 25平方厘米，三角斜颈 • 75平方厘米，正方斜颈 • 75平方厘米，三角斜颈 • 150平方厘米，正方斜颈

  17. 细胞培养板 • 6孔， • 12孔， • 24孔， • 48孔 • 96孔

  18. 细胞培养皿 • 35mm •  60mm  • 100mm 

  19. 冻存管 • 1.2ml • 2ml， • 5ml

  20. 离心管 • 15ml •  50ml • 细胞刮

  21. 滤 器 大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

  22. 液氮罐

  23. 何处购买细胞 • ATCC 细胞库(www.atcc.org). • 美国菌种保藏中心又称美国模式菌种收集中心(ATCC)是位于马里兰洲洛克菲勒的一家私营的，非赢利性组织。 • 目前它可以提供以下物品 细胞系3000种 细菌和噬菌体 15000种 动植物病毒 2500种 原生动物 1200种以及重组物品 • 欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库(RCB)

  24. 国内细胞库 中国科学院细胞库 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心联系方法：地址：上海市岳阳路320号，200031电话：021-54920404， 54920405Fax: 021-54920406联系人：陈松华，徐惠均e-mail: shchen@sibs.ac.cn

  25. http://sub.whu.edu.cn/cctcc/fzlbc/pywml.htm • 中国典型培养物保藏中心 也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定的专利培养物/生物材料／菌种保藏机构

  26. 订购程序 • 向中心订购培养物，可查阅CCTCC培养物目录，并向CCTCC提出订购培养物的名称、CCTCC保藏号等内容。 • 联系方式可通过电话、传真，信函，电子邮件等方式。 电话：027-87682319 传真：027-87883833 E-mail:cctcc@whu.edu.cn • 细胞系：300～500元/每株 • 菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。

  27. 细胞的营养 • 碳水化合物、氨基酸和脂类三大类 • 也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素

  28. 细胞培养液 • 水 • 平衡盐溶液 • pH调节液 • 消化液 • 抗生素溶液 • 培养基

  29. 细胞培养用液的配制 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 桶装水：怡宝

  30. 平衡盐溶液 • 主要由无机盐和葡萄糖配制而成 • 作用 维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 • 常用的缓冲液 生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hank‘s常用于配制胰酶溶液）

  31. pH调节液 (1) 碳酸氢钠液 (2) Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂 通常使用浓度为10～15mM

  32. 消化液 • 胰蛋白酶溶液 • 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来 • 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。 • (2) EDTA溶液 • 作用机制是破坏细胞间的连接。 • 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 • EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶 • (3)胶原酶溶液 • 胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤。

  33. 抗生素溶液 • 通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。 • 青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。 • 培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 • 庆大霉素：每毫升100单位

  34. 培养基 • 分天然培养基和合成培养基 • 天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）

  35. 合成培养基 • 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。 • 包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物 • 目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、 • 另有无血清培养基、无蛋白培养基

  36. RPMI1640 • 最初是由G，E，Moore为培养小鼠白血病细胞而设计的。 • 开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要是针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。 • 其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。 • 尤其适合人白细胞，如H9、T-15、HL-60、IM-9、Jurkat、 K-562 及KATO—III等细胞系的培养。

  37. RPMI1640种类 • RPMI—1640（A） （不含谷氨酰胺、可高压灭菌） • RPMI—1640（A）无酚红 （不含谷氨酰胺、高压灭菌） • RPMI—1640 （含谷氨酰胺、除菌过滤灭菌）

  38. DMEM细胞培养基 • 是在MEM培养基的基础上研制的 • 与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500g/L）和低糖型(低于1000g/L)。 • 高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。 • DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】 DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】 DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】。

  39. 干粉培养基的配制 • 认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 • 配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。 • 配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。 • 所用器皿应严格消毒。 • 配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。

  40. 血清的使用 • 血清质量好坏是实验成败的关键 • 常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清是品质最高的。 • 优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 • 血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。 • 血清的消毒 过滤除菌。

  41. 牛血清 • 胎牛血清应取自剖腹产的胎牛 • 新牛血清取自出生24小时之内的新生牛 • 小牛血清取自出生10－30天的小牛 • 使用浓度： 一般为5－20％，最常用是10％

  42. 何谓FBS、FCS、 CS、HS ? • FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。 • CS (calf serum) 则是指小牛血清 • HS (horse serum) 则是指马血清

  43. 血清解冻步骤 • 逐步解冻法 – 20℃或–70 ℃至4 ℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。 • 勿直接由–20 ℃至37 ℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

  44. 无机盐 • CaCl2、KCl 、MgSO4、NaCl 、NaHCO3、NaH2PO4 • 对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。

  45. 氨基酸 • 缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型) • 细胞用以合成蛋白质的必需原料，不能由其他氨基酸或糖类转化合成 • 谷氨酰胺具有特殊的作用，补加一定量的谷氨酰胺 。 • L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性 。

  46. 休息一会儿吧！ • 伸伸退，弯弯腰！

More Related