实验七利用 GUS 基因表达观察启动子功能

实验七利用GUS基因表达观察启动子功能 一、实验目的 1.了解报告基因及其应用； 2.学习启动子功能研究的方法。

二、实验原理 1.真核基因转录调控的基本原理在真核生物中，通过顺式调控元件和反式作用因子的相互作用，对基因表达进行调控。

顺式调控元件 启动子 Promoter 增强子 Enhancer / 沉默子Silencer • 能被序列特异性DNA结合蛋白识别的DNA 位点 • 为RNA聚合酶II启动转录及实现最大转录效率所需

反式作用因子 是一些能结合核心启动子和启动子近端元件的调控蛋白，能协助RNA聚合酶II启动转录，并与聚合酶形成启动复合物。 • 基本转录因子Basal transcription factors • 活化子Activators /抑制子repressors

The molecular apparatus controlling transcription in human cells

2.启动子（Promoter） • 启动子是位于基因5‘端近旁的一段调控序列，能作为RNA聚合酶的结合位点，同时也是转录因子结合的位点。 • 启动子的功能可以通过报告基因进行方便的检测。

3.报告基因(reporter gene) • 是一种编码容易被检测的蛋白质或酶的基因。 • 将某个基因表达调控序列与报告基因编码序列相融合，利用报告基因表达研究该基因表达调控。 • 利用报告基因与其它目的基因融合蛋白的表达，进行蛋白定位。

报告基因的特点： • 报告基因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似的产物； • 受体细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测； • 报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好。

常用的报告基因 β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）氯霉素转乙酰酶基因（cat）新霉素磷酸转移酶基因（npt-II) 绿色荧光蛋白基因（gfp）冠瘿碱合成酶基因 β-半乳糖苷酶基因

绿色荧光蛋白基因green-fluorescent protein, gfp 一种腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白，能在一定波长的紫外线激发下发出绿色荧光。优点： 1.适用于各种生物的基因转化； 2.检测方法简便，无需底物、酶、辅因子等物质； 3.便于活体检测，十分利于活体内基因表达调控的研究。

拟南芥根部GFP的表达 Laser ablation of the quiescent center （静止中心）in the post-embryonic root(后胚根). Confocal scanning images (共聚焦扫描成像)from the same root.

β-葡萄糖苷酸酶（GUS）基因 由uidA编码，其产物是葡萄糖苷酶（β-glucuronidase)，该酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。广泛用于转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其在研究外源基因瞬时表达的转化实验中。

GUS检测方法 组织化学染色定位法 (定性) 能够将无色的底物x-gluc催化生成蓝色的产物。荧光法（定量）以4-甲基伞形酮酰-β-D葡萄糖醛酸苷为底物，GUS催化其水解为4-甲基伞形酮及β-D葡萄糖醛酸。 4-甲基伞形酮分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。

GUS activity in the shoot of Arabidopsis 中柱内皮皮层表皮

Scale bars 100 m. GUS activity in the shoot of Arabidopsis A: mature trichomes (表皮毛）; C, cotyledon guard cells (子叶和保卫细胞); D, stipules （托叶）; H, veins of cotyledon and hypocotyl (胚轴); N, veins of hypocotyl and cotyledon petiole（叶柄）; P, cotyledon and leaf blade (子叶和叶片)

本实验原理简介 植物激素(Auxin)能调控植物生长和发育的各个方面，包括细胞分裂(cell division)、细胞伸长(cell elongation)、细胞分化(cell differentiation)和器官形成(the initiation of organ formation)等。吲哚乙酸(IAA)在植物体内普遍存在，是生理活性最强的生长素。

Aux/IAA genes Aux/IAA基因家族编码18- to 35-kD的短命转录因子，加入生长素5~60分钟后，大部分AUX/IAA家族就表达。这类基因的启动子区含有TGTCTC生长素反应元件( auxin-responsive promoter elements， AuxREs)。

本实验内容 1. 构建ProIAA2::GUS转基因拟南芥，利用GUS染色反应，观察IAA2基因表达的组织特异性及外源生长素对IAA2基因表达的影响。 IAA2 promoter GUS Nos-ter IAA mRNA

观察GUS表达的组织特异性： 观察不同组织（根，叶等）GUS活性的强弱。出现蓝色的地方即就是启动子工作的地方，即IAA2基因表达的地方。观察影响基因表达的因素：影响GUS表达的因素就是影响启动子功能的因素。如：外源生长素处理。实验中, 我们将在根冠和原韧皮部看到蓝色，因此生长素是影响IAA2启动子工作的因子之一。

2.利用DR5::GUS转基因拟南芥，观察GUS阳性的位点，即体内auxin分布的特点2.利用DR5::GUS转基因拟南芥，观察GUS阳性的位点，即体内auxin分布的特点 • DR5是含有7个串联重复的生长素反应元件（TGTCTC）的人工构建的启动子 • DR5 启动子活性的高低依赖于生长素的浓度，更快速、灵敏地反映了细胞内生长素的水平。 The DR5 reporter construct is widely used to monitor auxin response-level. DR5 consists of seven repeats of an auxin-response element (AuxRE) which is a binding site for auxin-responsive transcription factors (ARFs).

实验材料 • ProIAA2::GUS转基因无菌苗； • 0.1M IAA处理1天的ProIAA2::GUS转基因无菌苗； • DR5(含有7个生长素反应元件)::GUS转基因无菌苗。

三、实验步骤 1.育苗：将ProIAA2::GUS、ProDR5::GUS转基因拟南芥种子经表面消毒后接种于无菌的琼脂培养基。 2.生长素处理：将ProIAA2::GUS小苗转接至含有生长素(0.1M IAA)的新鲜培养基中处理1天。 3.取不同处理的材料（如整株小苗、叶片或根）放入微量离心管进行GUS染色，37ºC染色0.5-1.5h；如观察叶片，需要将染色后的叶片在95%乙醇浸泡5-60min，以除去叶绿素。 4.镜检: 在低倍镜或解剖镜下观察不同材料、不同组织、不同处理条件下GUS表达的部位及强弱差异。

拟南芥根结构的模式图 pIAA2S::GUS, pIAA2L::GUS和DR5::GUS拟南芥幼苗GUS表达部位及响应生长素的差异;

The DR5 Auxin Reporter Maximum in the Arabidopsis Root Is Modulated by Auxin Response -- + 2,4-D

Reference An Auxin-Dependent Distal Organizer of Pattern and Polarity in the Arabidopsis Root Cell, 1999(99): 463–472 AUX1 Promotes Lateral Root Formation by Facilitating Indole-3-Acetic Acid Distribution between Sink and Source Tissues in the Arabidopsis Seedling The Plant Cell, 2002 (14): 589–597

实验七 利用 GUS 基因表达观察启动子功能