Fotorecezione

1. Fotorecezione Dr. Paola Perin Dipartimento di Scienze Fisiologiche-Farmacologiche Cellulari-Molecolari – Università di Pavia

2. Cosa e’ la luce • Luce visibile: radiazioni elettromagnetiche con l tra 400 e 700 nm • I raggi luminosi viaggiano in linea retta nel vuoto o in un mezzo isotropo • Alla superficie di contatto tra due mezzi si puo’ avere: • Rifrazione (mezzi trasparenti) • Riflessione (mezzi opachi) • Assorbimento (dipende dalla struttura chimicofisica)

3. Ma noi cosa vediamo? Luce riflessa o prodotta dall’oggetto • La visibilita’ di un oggetto dipende dall’intensita’ dei raggi luminosi che ne escono • La luminosita’ di un oggetto dipende: • Dalle sue caratteristiche intrinseche • Dalla illuminazione che riceve • Variazioni su 10 ordini di grandezza Quantita’ di luce che entra nell’occhio Intensita’ di illuminazione

4. Oggetti chiari, oggetti scuri • Le onde EM interagiscono con le nuvole elettroniche delle molecole degli oggetti • Fotoni di determinate l vengono assorbiti e/o emessi quando provocano/derivano da transizioni elettroniche • Sostanze diverse assorbono luce di diverse l • Illuminando un oggetto con una luce bianca, l’oggetto riflettera’ solo la luce che non assorbe (quindi una sostanza che assorbe la luce a brevi l apparira’ rossa) • Un oggetto che assorbe tutta la luce che riceve appare nero

5. Contrasto oggetti-sfondo • Caratteristiche del segnale visivo che vengono percepite: • Contrasti di luminosita’ • Movimento coerente • Differenze di colore • L’immagine visiva NON e’ una fotografia ma un segnale molto piu’ elaborato!

6. Il globo oculare • Tessuti trasparenti per facilitare il passaggio della luce • Fondo scuro per evitare luce riflessa (degrada la qualita’ dell’immagine) • Diaframma regolabile per dosare la luce • Lente con rifrazione variabile • Sistema di pulizia della superficie (lacrime) • Meccanismi di posizionamento (muscoli extraoculari) • Segnale in uscita: nervo ottico

7. Formazione dell’immagine retinica • Il sistema di lenti dell’occhio forma una immagine invertita e rimpicciolita degli oggetti sulla retina • Il funzionamento e’ simile alle lenti di una macchina fotografica • Distanza focale del cristallino a riposo: 17 mm

8. La retina • La retina e’ un foglio che ricopre la superficie posteriore dell’occhio • Punto di uscita del nervo ottico: punto cieco • Regione di massima acuita’: fovea

9. Anatomia della retina • La retina contiene tre strati di cellule: • Fotorecettori • Cellule bipolari • Cellule gangliari • L’epitelio pigmentato assorbe la luce che ha attraversato I fotorecettori • Le cellule orizzontali e amacrine modulano il segnale visivo trasmesso dai fotorecettori • Gli assoni delle cellule gangliari formano il nervo ottico Luce

10. Coni e bastoncelli • I fotorecettori della retina si dividono in coni e bastoncelli • I bastoncelli sono piu’ sensibili dei coni alla luce ma piu’ lenti e (nei mammiferi) non distinguono le l • Nei primati i coni sono di tre tipi: • Blu (short l) • Verdi (medium l) • Rossi (long l)

11. Visione tricromatica • I coni blu hanno una sensibilita’ inferiore a quella dei coni verdi e rossi • Il confronto tra lo stimolo che arriva ai tre tipi di coni consente di differenziare I vari colori • Diverse miscele di l danno la stessa sensazione

12. La percezione del colore • L’attivazione di un tipo di cono non da’ di per se’ la percezione del colore • Attivando in uguale misura tutti I coni si ottiene grigio o bianco • Il colore risulta dal contrasto tra I segnali dei tre coni • Il sistema RGB si basa sui tre colori primari dei coni • Il sistema Lab si basa sui tre gradienti primari della retina (luminanza-rosso/verde-giallo/blu)

13. Anomalie della visione cromatica • Protanopia: assenza di pigmento rosso • Deuteranopia: assenza di pigmento verde • Tritanopia: assenza di pigmento blu • I numeri di Ishihara vengono usati come test per le anomalie della visione cromatica

14. Proporzioni relative dei fotorecettori • Le proporzioni relative di coni e bastoncelli variano nelle regioni della retina • Nella fovea non ci sono bastoncelli • coni S: 3-5% dei coni foveali, 15% dei coni ai lati della fovea e 8% nelle altre regioni • coni M e L: difficili da distinguere - proporzioni variabili anche tra individui di una stessa specie • 1 retina: • 120 x 106 bastoncelli • 6 x 106 coni • Schermo di questo computer: • 106 pixel

15. La fovea • La fovea e’ la regione della retina con maggiore acuita’ visiva e migliore percezione dei colori • La fovea pero’ non funziona quando l’illuminazione e’ scarsa! • A livello della fovea ci sono solo fotorecettori - gli strati superiori sono spostati di lato

16. Istologia dei fotorecettori Segmento esterno Segmento esterno Segmento interno Segmento interno Terminale sinaptico (sferula) Terminale sinaptico (pedicello)

17. La fototrasduzione • I dischi del segmento esterno contengono la proteina rodopsina (108 copie/bastoncello) • Recettore a serpentina 7TM accoppiato ad una proteina G • Retinale (derivato dalla vitamina A) legato alla rodopsina in forma 11-cis • cis-retinale + fotone di luce visibile = trans-retinale (35 fs) • cambiamento conformazionale della rodopsina. • Rodopsina • (altri intermedi metastabili) • Metarodopsina II • Opsina+retinale (alcuni ms) • Circa il 50% dei fotoni che attraversano un fotorecettore vengono assorbiti • L’efficienza della trasduzione e’ del 67% • 1/3 dei fotoni vengono segnalati con una risposta del recettore

18. La cascata della fototrasduzione • Al buio, nei fotorecettori e’ fortemente attiva una guanilato ciclasi, che produce tonicamente cGMP • Il cGMP mantiene aperti i canali CNG che portano una corrente cationica • La metarodopsina II attiva la trasducina (proteina G trimera, Gt) • Gta stimola una GMP ciclico fosfodiesterasi (cGMP-PDE) La luce riduce la concentrazione di cGMP e CHIUDE I canali ionici CNG

19. La corrente al buio Buio Luce Stimolo (luce) Segmento esterno Corrente attraverso la membrana del segmento esterno Potenziale di membrana Al buio I fotorecettori sono depolarizzati (Vz=-35/-40 mV) per la presenza di una corrente entrante stazionaria (corrente al buio) La luce chiude la corrente entrante e iperpolarizza i fotorecettori (-70 mV) La PDE e’ un’enzima molto attivo (reazione limitata dalla diffusione del cGMP) L’attivazione di 1 molecola di rodopsina idrolizza fino a 105 molecole di cGMP Quando tutti i canali sono chiusi la risposta non puo’ piu’ aumentare (saturazione)

20. I canali cGMP-sensibili Canali cGMP- sensibili • Canali cationici nonselettivi localizzati nel segmento esterno • La corrente stazionaria portata da questi canali innalza la [Na+] citoplasmatica dei fotorecettori • Nel segmento interno una Na/K-ATPasi elimina il Na+ e aumenta il K+ citoplasmatici • Canali selettivi per il K nel segmento interno chiudono il circuito Corrente al buio Canali selettivi per il K+ Na/K-ATPasi

21. L’adattamento alla luce • Entrambi i fotorecettori adattano alla luce in pochi minuti • I coni adattano piu’ in fretta dei bastoncelli e per intensita’ luminose piu’ elevate

22. Adattamento della fototrasduzione nel segmento esterno Il Ca2+ inibisce la guanilato ciclasi Il Ca2+ viene rimosso continuamente da uno scambiatore Na+/K+-Ca2+ Il Ca2+ inibisce la rodopsina chinasi che inattiva la metarodopsina II L’affinita’ dei canali CNG al cGMP e’ diminuita da Ca/ CaM [Ca2+] elevata (0.5 mm) I canali CNG sono permeabili al Ca2+ Riduzione di [Ca2+] = aumento di [cGMP] Uno stimolo luminoso prolungato riduce la [Ca2+]

23. Adattamento della fototrasduzione nel segmento esterno • Adattamento varia la sensibilita’ della risposta • Bastoncello adattato al buio: 1 fotone chiude il 5% dei canali CNG in 1s • Saturazione dei bastoncelli: 10000 fotoni/s • Nei coni non si ha quasi mai saturazione completa • Dopo adattamento: canali CNG > aperti ma <sensibili • Legge di Weber • Adattamento varia anche la cinetica della risposta • Rodopsina chinasi inattiva la rodopsina in alcuni ms • Metarodopsina II stabile per vari secondi

24. Adattamento

25. Intensita’ percepite

26. Aumento di luminosita’

27. Adattamento della sensibilita’

28. Differenze nella trasduzione nei coni e nei bastoncelli Bastoncelli: • maggiore superficie fotosensibile • maggiore amplificazione • Interazione rodopsina-trasducina piu’ rapida • Canali CNGA1/CNGB1a Coni: • Canali CNGA3/CNGB3 • Isoforme diverse di: • Pigmento • trasducina • PDE • arrestina • Maggiore [RGS9] La risposta dei coni e’ piu’ rapida (50-55 Hz invece di 10-12) ma meno sensibile

29. I pigmenti fotosensibili • Sia I coni che I bastoncelli usano l’isomerizzazione del retinale • Nei coni le proteine sono dette conopsine o iodopsine e sono simili alla rodopsina ma con proprieta’ spettrali diverse • Le opsine verde e rossa sono molto simili tra loro: duplicazione genica relativamente recente (primati)

30. Potenziale di recettore Segmento esterno • L’assorbimento di uno o piu’ fotoni nel segmento esterno produce iperpolarizzazione • Le dimensioni dei fotorecettori (70-100 mm) consentono la propagazione passiva dei segnali di potenziale dal segmento esterno a quello interno e al terminale sinaptico • I fotorecettori non generano potenziali d’azione ma solo potenziali di recettore locali Terminale sinaptico

31. Segregazione del Ca2+ Segmento esterno • Segmento esterno: • Ca2+ implicato nell’adattamento della cascata di fototrasduzione • Ingresso: CNG • Uscita: NCKX • Terminale sinaptico: • Ca2+ implicato nel rilascio sinaptico di neurotrasmettitore • Ingresso: canali voltaggio-dipendenti (+CNG nei coni) • Uscita: PMCA Terminale sinaptico

32. Terminale sinaptico Contiene vescicole di glutamato legate ad un nastro sinaptico di natura proteica Sinapsi chimica con canali per il Ca2+ attivati dalla depolarizzazione Canali di tipo L: Cav1.3 nei coni, Cav1.4 nei bastoncelli Rilascia tonicamente trasmettitore al buio (-35 /-40 mV) La luce riduce il rilascio di neurotrasmettitore(iperpolarizzazione) Nei coni una parte del rilascio e’ voltaggio-indipendente

33. Le sinapsi dei bastoncelli Sferule dello strato plessiforme esterno Sinapsi a triade: 1 elemento presinaptico (bastoncello) contatta due elementi postsinaptici (cellula orizzontale, giallo, e cellula bipolare, rosso)

34. Le sinapsi dei coni Pedicelli dello strato plessiforme esterno Due tipi di contatti con le cellule bipolari: Contatti invaginanti (rosso) e contatti appiattiti (blu)

35. Sinapsi tra fotorecettori • I terminali di fotorecettori adiacenti sono collegati da sinapsi elettriche (gap junctions) • I coni blu non hanno questo tipo di sinapsi • A cosa servono questi contatti? • Ipotesi: il segnale dei coni e’ piu’ veloce, quello dei bastoncelli piu’ sensibile: accoppiamento da’ alle cellule bipolari un segnale veloce e sensibile

36. Le cellule bipolari • Il segnale luminoso viene comunicato attraverso il terminale sinaptico dal fotorecettore alle cellule bipolari • Per I bastoncelli si ha una notevole convergenza (15-30 bastoncelli/cellula bipolare) • Il trasmettitore rilasciato e’ il glutamato • Il glutamato viene rilasciato al buio e il suo rilascio viene ridotto dalla luce

37. Cellule ON e OFF • Se si illuminano i fotorecettori direttamente in contatto con una cellula bipolare questa puo’ dare due diverse risposte: • Risposta OFF: la cellula si iperpolarizza • Risposta ON: la cellula si depolarizza!! • Le cellule bipolari OFF hanno un recettore eccitatorio per il glutamato • Le cellule bipolari ON hanno un recettore INIBITORIO per il glutamato • Nei mammiferi tutte le cellule bipolari accoppiate ai bastoncelli sono ON

38. Recettori per il glutamato • Cellule orizzontali: recettori AMPA/kainato • Cellule bipolari-OFF: recettori di tipo AMPA/kainato • Cellule bipolari-ON recettori metabotropici inibitori (mGluR6) • Non e’ chiaro quale sia il secondo messaggero utilizzato dalle CB-ON

39. Le cellule bipolari • Postsinaptiche ai fotorecettori • Presinaptiche alle cellule gangliari e amacrine • Possono generare potenziali d’azione dovuti al Ca2+ • Sia le sinapsi con I fotorecettori che con le cellule gangliari sono sinapsi a nastro glutamatergiche • Le cellule bipolari (CB) formano sinapsi glutamatergiche con le cellule gangliari (CG) • La sinapsi con le cellule gangliari e’ fasica (depressione post-stimolo) • Le cellule gangliari hanno solo recettori eccitatori

40. La via diretta • Il circuito piu’ semplice nella retina contiene: • uno o piu’ fotorecettori • Una o piu’ CB • Una CG • In questo circuito lo stimolo efficace e’ una luce (o un’ombra) che colpisce una regione ristretta della retina • L’entita’ della convergenza e’ estremamente variabile

41. Tipi di cellule bipolari • Nei primati ci sono 10 tipi di CB • Le cellule nane (midget cells) della fovea non hanno convergenza: ricevono input da 1 solo cono e trasmettono output a 1 cellula gangliare • Massima discriminazione spaziale

42. Campi recettoriali • Un singolo cono risponde alla luce su una piccola frazione di retina

43. Contrasto centro-periferia • Una CB che raccoglie le risposte di piu’ fotorecettori dovrebbe avere meno sensibilita’ spaziale • Quindi illuminando una regione via via piu’ estesa della retina si dovrebbe avere una risposta via via maggiore della CB • In realta’ le CB hanno una risposta bifasica (centro-periferia)

44. La sinapsi dei fotorecettori • I fotorecettori rilasciano glutamato a riposo • La luce iperpolarizza I recettori… • Depolarizza le CB-ON dei bastoncelli e dei coni… • Iperpolarizza le CB-OFF dei coni… • Iperpolarizza le cellule orizzontali

45. Le cellule orizzontali Illuminando un fotorecettore vengono iperpolarizzate le cellule orizzontali che esso contatta • Cellule inibitorie (GABAergiche o glicinergiche) • Assone corto o inesistente • Arborizzazione dendritica estesa nel piano dello strato plessiforme esterno • Ricevono input eccitatorio dai fotorecettori • Accoppiate tra loro con gap junctions (chiuse dai recettori D1 dopaminergici)

46. La via indiretta • I fotorecettori che contattano direttamente una CB (in blu) producono la risposta principale (centro) ON o OFF • I fotorecettori (in bianco) che contattano le cellule orizzontali connesse alla via diretta (in ocra) inibiscono I fotorecettori della via diretta e quindi hanno un effetto contrario sulla CB (eccitatori su CB-OFF e inibitori su CB-ON) • Si genera cosi’ opposizione centro-periferia

47. Campi recettoriali delle cellule gangliari

48. La visione a colori • I meccanismi di opposizione centro-periferia funzionano per la luminanza del segnale acromatico ma anche per I colori • Due tipi di opposizione cromatica: • Rosso-verde • Blu-giallo

49. Da dove viene il giallo? • Il giallo deriva dalla fusione dei segnali dai coni verdi e rossi • I coni blu hanno vie distinte fino al SNC • I coni rossi e verdi no (evoluzione piu’ recente)

50. La sinapsi dello strato plessiforme interno • CG solo postsinaptiche • CB, cellule amacrine hanno sinapsi bidirezionali • La via diretta CB-CG viene pesantemente modulata • Per I bastoncelli non c’e’ una via diretta nei primati • Cellule bipolari: 10 tipi diversi • Cellule gangliari: 20 tipi diversi • Cellule amacrine: 30 tipi diversi Via diretta: sinapsi CB-CG Via indiretta: sinapsi CB-cellule amacrine