Download
1 / 50
500 likes | 636 Vues
A Genomic Regulatory Network for Development. Davidson EH, et al. Science 2002 295(5560):1669-1678. Review. מבוא. התפתחות של "תוכנית" הגוף נשלטת בצורה קשיחה ע"י רשת גדולה של גנים רגולטורים. מאמר זה דן ברשת כזאת של התמיינות המסודרם והאנדודרם בעובר קיפוד הים.
E N D
A Genomic Regulatory Network for Development Davidson EH, et al. Science 2002 295(5560):1669-1678. Review.
מבוא • התפתחות של "תוכנית" הגוף נשלטת בצורה קשיחה ע"י רשת גדולה של גנים רגולטורים. • מאמר זה דן ברשת כזאת של התמיינות המסודרם והאנדודרם בעובר קיפוד הים. • הרשת נגזרה מאנליזות חסר-הפרעה רבות, בשילוב עם מטודולוגיות חישוביות, מידע גנומי, אנליזת ציס-רגולטורי ואמברולוגיה מולקולרית.
גישת תיאור המערכת או "מיתוג" בביולוגיה • הגישה הקודמת של האמבריולוגיה התמקדה בתיאור שלבים שונים של התפתחות העובר. • הגישה במאמר זה מנסה לשלב את כל הנתונים לכלל מערכת. • המערכת מתוארת למעשה כרשת רגולטורית של קודקודים שבה כל קודקוד מסמל גן (או תוצר שלו) וכל קשת מסמלת רגולציה. • ההסתכלות היא כמו הסתכלות על מעגל במיתוג. כלומר כל קודקוד יכול לקבל קלט ולעבד אותו, שימוש במעגלי משוב וכו'.
שער "מיתוגי-ביולוגי" גן מטרה פקטור שיעתוק אזורי הבקרה
ה"ארכיטקטורה" של הרשת מגלה היבטים ספיציפיים לגבי התפתחות קיפוד הים וכלליים של התפתחות. • לדוגמא כיצד תאים ספיציפיים מחוללים את התהליך שקובע את גורלם, ומדוע התהליך מתקדם באופן "קשיח" ומובנה בגנום.
הגישה הישנה למחקר הייתה של בחינת גן אחד או מעט גנים בזמן מסוים, שיטה שלא מתאימה לרשת מתואמת של הרבה גנים רגולטורים. • במערכת הציס-רגולציה כל אחד מקודקודי הרשת, מעבד קלט אינפורמציה "קינטי": עליה וירידה של פעילות של פקטורי טרנסקריפציה אליהם הוא מגיב
סט גנים א1 סט גנים א2 סט גנים ב1 • ניתן לבחון את קשרי הרשת ע"י cis-regulatory analysis. כלומר, זיהוי אלמנטי ה-control, זיהוי אתרי המטרה שלהם, ובדיקה ע"י ניסוי של החשיבות הפונקציונלית של אתרי המטרה. • ההתפתחות מתקדמת כרצף של מצבים שמוגדרים באופן מרחבי של ביטויי גנים רגולטורים. זה הוא התהליך שבכל איזור מרחבי של האורגניזם מתחיל לבטא סט אחר של גנים רגולטורים. סט גנים א' סט גנים ב'
מאיפה באים הקלטים ? • האותות המרחביים שמפעילים את הספיציפיקציה הם "ליגנדי איתות" שנשלחים ע"י תאים אחרים ששולחים אותם עקב המצאות בעצמם במצב כלשהו של ספיציפיקציה. • בנוסף לאיתותים בין תאיים, מולקולות בעלות חשיבות רגולטורית של האם (להלן אותות מטרנליים) מועברים בביצית ומפוזרים באופן מרחבי עם ההתבקעות.
ייחודיות הרשת הרגולטורית • הייחודיות של כל רשת רגולטורית התפתחותית הינה במודלים האופרטיביים הציס-רגולטורים. • הגנים הללו פעמים רבות לא משמשים רק כקשר פשוט בין קלט לביצוע אלא גם כמעין מעבדים – לדוג' הרבה פעמים הם משתמשים בלוגיקת –and 2 גורמי שעתוק חייבים להיות קשורים באותו הזמן לאתר ציס-רגולטורי בדנ"א על מנת שהטרנסקרפציה תצא לפועל.
קצת על התפתחות קיפוד הים לעומת מחקרי התפתחות אחרים • אין עדיין שום מקרה שבו הצליחו למפות קישוריות סיבתית מהרצף הגנומי לתהליך עקרי של התפתחות של יצור בילטרלי (דו צדדי). • אחת מהסיבות לכך שלא הצליחו היא שרב מערכות תהליכי ההתפתחות שנחקרו באופן אינטנסיבי הם של התפתחות של אברים של מבוגרים. • בהתפתחות אברי מבוגרים, רקמה של איבר מתפתחת מרקמה שהיא בעצמה כבר מפותחת – הדבר הזה מקשה משום שהוא יוצר דפוסים מורכבים שנוצרו מדפוסים מורכבים קודמים.
הגן endo16 • הגן מקודד לחלבון פולי-פונקציונלי גדול שמופרש לחלל העוברי של המעי האמצעי (הלא מפותח). • השלבים המוקדמים והמאוחרים נשלטים ע"י 2 תתי איזורים שונים של הרצף הרגולטורי. • כל אחד מתתי האיזורים מכיל כמה מאות בסיסים. ביחד הם עוברים רגולציה ע"י 9 פקטורי שעתוק שונים.
שימושים של מערכת מודל שלב ראשון של רשת רגולטורית • מודל מושלם של הרשת יאפשר לראות את הארכיטקטורה הבין-גנית שלה, ואת תהליכי עיבוד המידע של כל צומת ברשת (קלט ופלט ושיטה) • המטרה העקרית היא להגיע למודל שלם של הרשת הרגולטורית. • החוקרים הגיעו למודל כזה לגבי ספיציפיקציה של האנדומסודרם בעובר של קיפוד הים.
במונחים אבסולוטים מספר הגנים במערכת הוא די גדול (כיום ידועים כמעט כ-50), אבל הם רק מעט מאד מהגנים שמבוטאים בעובר, שמוערכים כיום בכ-8500. • יש 2 דרכים להתייחס למודל כזה: • 1. התייחסות אחת המקבילה להסתכלות מהצד הגנומי- • פונקציונלי. • וזה למעשה להסתכל על המעגל בשלמותו: • במודל מראים בו זמנית את כל הקלטים שנכנסים לכל אלמנט ציס-רגולטורי. ואת זה מראים לגבי כל התאים ובכל נקודות הזמן של תהליך ההתפתחות. • זה מראה את הארכיטקטורה הגנטית של הרשת ומנבא • את אתרי המטרה.
2. ההתייחסות השנייה מהצד של ביולוגיה של התפתחות. או למעשה להסתכל על הקונפיגורציה הרגעית של הרשת בתא מסויים בזמן מסויים: • המבט מסתכל בעיקר על האינטרקציות שקורות בגרעין נתון בזמן נתון. וזה מסביר מדוע גנים מבוטאים או לא, בזמנים שונים בתאים שונים.
למה קיפוד ים? • הביולוגיה של עובר קיפוד הים מציעה יתרונות טבעיים לאנליזה של רשת רגולטורית של התפתחות. • לא הרבה צעדים רגולטורים מפרידים בין שלב תחילת הזיגוטה לבין ההפעלה הטרמנלית של גנים של התפתחות ודיפרנציאציה. • עובר קיפוד הים מפתח צורות מוקדמות פשוטות ביותר עם רק כ-10-12 סוגי תאים. בניגוד להתפתחות המורפולוגית המסובכת של גרסאות "ילדותיות" של רקמות מבוגרים בהתפתחות בחרקים ובבעלי החוליות.
בנוסף על כך גם תריסרים של גנים התפתחותיים-רגולטורים שובטו. תבניות הביטוי העובריות תוארו כבר, והגנום כבר די אופיין יחסית. קיימות גם ספריות של cDNA, וספריות BAC. • הביציות גדולות וצלולות – מאפשרות בקלות לראות פנוטיפים. • ניתן להשיג את הביציות בכמויות גדולות בקלות. • הכי חשוב למטרה הנוכחית עובר קיפוד הים מהווה מערכת בעלת תפוקה גבוהה לביצוע אנליזת ציס-רגולטורי ע"י gene transfer.
ספיציפקציית האנדומסודרם בעובר קיפוד הים • ה- endomesoderm של עובר קיפוד הים מתפתח מאב קדמון בקצה הדרומי של העובר המוקדם. • ה- endomesoderm של העובר מכיל בסופו של דבר את ה- mesenchyme (מצבור התאים שמתפתח לרקמת החיבור או לדם שמקורו ב-micromere), כמה סוגי תאי mesoderm אחרים ואת שכבת אנדודרם של המעי. • רב שכבת האנדודרם של המעי ורב התאים המסודרמים מתפתחים כצאצאים של טבעת של 8 -6 תאי ביקוע שנקראים "veg2" כל שאר שכבת האנדודרם של המעי מתפתחים מ-8 תאי "אחות" שנקראים "veg1".
לוונדר (סגול בהיר) - skeletogenic lineage. סגול כהה - the small micromere precursors of adult mesoderm אפור כהה- aboral ectoderm ירוק בהיר - endomesodermal veg2 lineage that later gives rise to endoderm צהוב - endoderm כחול בהיר - mesoderm אפור בהיר- oral ectoderm (שכבה חיצונית של "הפה")
10 שעות – חתך אופטי אמצעי של בלסטולה מוקדמת בערך לאחר ביקוע שביעי 15שעות – כנ"ל לאחר כ-9 ביקועים 24 שעות - שלב ה- mesenchyme בלסטולה. ספיציפקציה של veg2 אנדודרם, ושל תאים מסודרמליים הושלמה. 55 שעות – שלב הגסטלורה המאוחרת (בערך 800 תאים). הציור מתאר את הפריסה של כל התאים האנדומסורמיים בערך בחצי הדרך של המורפוגנזה (עיצוב צורת האורגניזם במהלך התפתחותו)
סיגנל 1 אבות ישירים של veg2 לספציפיקציה של צאצאי VEG2 באב הקדמון של האנדומסודרם יש צורך ב-2 קלטים: סיגנל אחד מועבר מהמיקרומרים לאבות הישירים של טבעת הveg2 בביקוע ה4-6. מיקרומרים
והשני הוא הצטברות של catenin בגרעיני התאים המתאימים שהם התאים האנדומסודרמים. catenin הוא קופקטור של פקטור השעתוק Tcf וההצטברות שלו בגרעין היא אוטונומית ולא תלויה בסיגנל. catenin
Wnt8 עם זאת התאים האנדומסודרמיים די מהר מפעילים גן שמקודד לליגנד-סיגנל Wnt8, כאשר עם הקשרו לתאים שכנים מעורר signal transduction (מעין רשת סיגנלים – פקטורים וכ"ו) שגורמים להצטברות גדולה יותר של-catenin/Tcf בגרעין. כלומר מעין לולאה מגבירה. catenin
אנליזה של הרשת • הרשת הציס-רגולטורית של ספיציפקצית האנדומסודרם שהוצגה במאמר הופקה בחלקה מהרבה אנליזות "הפרעה", בהן ביטוי של הרבה גנים רגולטוריים ומערכות סיגנל שונו לשם הניסוי. • האפקט על הרבה גנים אחרים נמדדו ע"י ראקציית מדידה בזמן אמת של PCR זרחני. • על מנת שקלט ייחשב בעל חשיבות האפקט של ההפרעה צריך היה להיות שונה בסדר גודל של שלושת מונים. כלומר קצב שעתוק גן המטרה היה צריך להיות <30%,>300% ממדידות הביקורת.
GFP )חלבון זוהר) תרגום Pmar 1 mRNA שעבר fusion איזור קשירה של pmar1 גן
GFP )חלבון זוהר) (מכבים את האור ורק ה GFP נשאר זוהר בחושך...)
Morphilino oligonucleotide. GFP )חלבון זוהר) תרגום mRNA שעבר fusion Pmar 1 איזור קשירה של pmar1 גן
רב הקשרים ברשת שנתגלו במחקר הנ"ל מבוססים על הפרעות שסילקו פונקציות, כמו morpholino-substituted antisense oligonucleotides • או חסימה של כל ספיציפקציית האנדומסודרם או המסודרם. • החוקרים השתמשו גם חיברו ((fusionmRNA שמקודד לגורם שעתוק וmRNAשמקודד לדומיין של הגן Engrailed(גן שעושה רפרסיה). החיבור גרם לכך שבכל איזור שבו הפקטור נקשר הוא גורם להפסקת השיעתוק שם.
mRNA -ים שמקודדים לגנים שאותם רצו החוקרים לבדוק, הוחדרו לביצה בכמות שתגביר בסדר גודל את הכמות המקורית ולעיתים אפילו בכמה סדרי גודל. • יש לזכור שלמעשה ההגברה קטנה יותר, מכיוון שיש התכלות של ה-mRNA החיצוני.
לבד, אנליזה של הפרעות לא יכולה להבחין בין השפעות ישירות ולא ישירות. • ניתן להשתמש באנליזה ציס-רגולטורית על מנת לבדוק אם השפעה היא ישירה או לאו. • נסיונות אחרים שנעשו הם נסיונות לגרום לביטול ההפרעה ע"י הוספת mRNA שמקודד לפקטור אחר שיכול להיות מתווך של הפקטור שפגענו בו.
בתהליך שחוזר על עצמו, התוצאות מהאנליזות נבדקו כנגד המודל, תוכננו עוד ניסויים, המודל שונה בהתאם לתוצאות וכן הלאה. • המודל נבנה ע"י התוכנית Netbuilder , מכשיר חדש לשם בנייה מודל חישובי שמאפשר סימולציה ע"מ לבדוק האם הקשרים שנבנו מתאימים לתוצאות.
מאמץ גדול במיוחד הושקע בגילוי גנטי על מנת לגלות את הגנים שמסתתרים תחת האינטרקציות האמברולוגיות, ולהוסיפם לגנים שגולו כבר שמעורבים בספציפקציה של האנדומסודרם. • נעשו מספר ניסויים בהם הופרעה ספציפקצית האנדומסודרם ע"מ שיהיה חומר למבחני הפחתה-היברידיזציה רגישים שנועדו לשימוש עם macroarrays. • התוצאות עברו "דיגיטליזציה" ואובחנו ע"י תוכנה שמעבדת תמונה שנקראת BioArray שנועדה לשם אנליזה של differential macroarray screens
נמצאו גנים רגולטורים חדשים וגם גנים שמקודדים לחלבוני דיפרנציאציה באנדודרם ובמסודרם. • כנראה שרב הגנים הרגולטורים שקשורים לשעתוק, שמעורבים בספציפיקציה של האנדומסודרם עד 24 שעות כעת ידועים. • עם זאת, רק מספר קטן של גנים דיפרנציאיצים של האנדומסודרם, גולו וזאת מכיוון שרב המבחנים נעשו על שלבים מוקדמים של תהליך הספציפיקציה.
אנליזה ישירה של ציס-רגולטורי , חיונית ע"מ לבדוק את הקשרים הצפויים של הרשת. אבל המשימה של למצוא את האלמנטים הללו ברשת דרשה שיטות אחרות מאשר השיטות המסורתיות של חיפוש באופן ניסויי סביב הדנ"א מסביב לגן שאנו מעוניינים בו. • ע"מ לפתור את הבעיה הזאת החוקרים פנו לאנליזת רצףInterspecific: • ביצעו השוואה בין האיזורים של הגנים המבוקשים בין הזן שעליו עשו את כל הניסוי - S. purpuratusובין הזן Lytechinus variegatusשמתפתח בדרך דומה. על מנת למצוא איזורים דומים סביב הגנים. האיזורים הללו חשודים כאיזורי רגולציה ובמבחני gene transfer אכן מצאו את חלקם כאיזורי רגולציה. • החיפוש נעשה ע"י התוכנה FamilyRelations.
סה"כ נעשה שימוש ב-3 חבילות תוכנה: • Netbuilder, FamilyRelations, BioArray • ניתן להוריד אותן ב:http://sea-urchin.caltech.edu/software
קדם סיכום • אנליזה של רשת רגולטורית התפתחותית יכולה להיעשות על כל אורגניזם שניתן לעשות לו בקלות וביעילות החדרת גנים. • כמו כן כל שאר השיטות המולקולריות המשניות זמינות. • האנליזה דורשת תערובת של טכנולוגיות ורמה חדשה של שיתוף פעולה בין ביולוגים של מערכות למדענים חישוביים.
על מנת להבין מערכת רגולטורית והאינטרקציות שבונות אותה, חייבים להשתמש במודלים חישוביים: • ארגון ניסויי המשך. • בדיקת כל שלב של בניית המודל. • בדיקת עקביות. • שילוב תוצאות ניסוייות עם הארכיטקטורה הקיימת של הרשת ע"י אמצעים של סימולציה.
מודל הרשת מקשר בין המאפיינים הללו ועוד מאפייני התפתחות ותכונות של תהליך התפתחות האנדומסודרם ישירות לגנום. • המודל אם כן נותן תרשים של התוכנית המורשת של התפתחות, אבל התוכנית היא לא המכונה.
רשת הרגולציה של הדנ"א חיה יחד עם עוד מערכות מרובות חלקים אשר ביחד מרכיבות את המכונה. • מערכות אלו מפעילות את הפונקציות הביו-כימיקליות, מייצרות מסלולי העברת סיגנל, אשר בסה"כ גורמות לשינויים בתאים ביולוגיים לקרות. • גיוסם נשלט על ידי "מתגים" של שעתוק אשר מחברים אותם אל מערכת הרגולציה הגנומית.
אין ספק כי התפתחות של תוכניות גוף מורכבות היא תכונה של ה- Bilaterian. • קידוד של מערכת ההתפתחות היא תכונת רגולציה גדולה וחשובה בפונקציה של הגנום. • היה ברור כבר הרבה זמן כי האבולציה של תוכנית הגוף קרתה על ידי שינוי בתוכניות הגנומיות. • כעת זה ברור כי אנו צריכים להתחשב בזה במושגים של שינוי ברשתות רגולטוריות.
לכל ה- bilaterians יש פחות או יותר את אותה "קופסת כלים" גנטית. • אנליזה של רשת נותנת את האמצעים להתמקד על התוצאות המדויקות של השוני בשימוש בגנים הללו. • על מנת לפתור את שאלת אבולוצית התפתחות תוכנית הגוף יהיה עלינו: • 1. ללמוד כיצד שינויים ארכיטקטוריים ברשתות ההתפתחות יכולות להוסיף בכל שלב אבולוציוני, ועדיין לשמור על אפשרויות הביצוע של מה שהיה קודם.
2. להתייחס לרשתות רגולטוריות כ-"לוחות ציור של תבניות" אבלוציוניות של אינטרקציות רגולטוריות אשר בזה אחר זה נכתבות בו תבניות רגולציה חדשות. • הבנת מה הוא בע"ח הניתן לנו, כולל אנחנו. • היא למעשה: • הבנה איפה כל זיקה של הרשתות ההתפתחויות עלו, • אילו צורות חיים אחרות חולקות איתנו את אותן הזיקות, • אילו הן חדשות ואילו הן עתיקות.
רעיונות לדיון • כאשר גילו כי לאדם יש רק 30,000 גנים, הציעו כל מיני הסברים למורכבות הגדולה שלו כמו alternative splicing, וכו'. • מאמר זה יכול לתת הסבר לכך: ניתן לראות כי תוספת לינארית של גנים יוצרת עלייה אקספוננציאלית בסיבוכיות הרשת. • ייתכן וניתן ללמוד גם שיטות חישוביות חדשות מהביולוגיה!
