荧光显微镜

1. 荧光显微镜 徐辉 54237189 smxz@shmu.edu.cn

2. 荧光显微镜 • 染色法根据：标本的透光率差异 • 用于：常规明场显微镜 • 物理法 根据：折射率的差异双折射 • 用于：相差、微分干涉和偏光显微镜 • 荧光法 根据：荧光特性 • 用于：荧光显微镜

3. 荧光显微镜 什么是荧光？ 当一个物体吸收了紫外光或者短波光的能量，它能发射出比原来吸收的波长更长的光的特性。这种现象称为“荧光”或“磷光”。

4. 荧光显微镜 荧光的特性： 一.为了能发射出荧光，一种物质必须能吸收进一种 光线。 二.通常，荧光波长是长于吸收光的波长。 三.每一种物质都有他特定的荧光光谱。 四.通常，荧光强度总是远低于激发光。 五.与激发光的方向无关，荧光向空间各个方向发射。 六.荧光有衰退的特性。

5. 荧光显微镜 荧光染色分类： • 自发荧光 • 二次荧光 • 抗体荧光技术

6. 荧光显微镜 自发荧光（不加染色） 有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。

7. 荧光显微镜 二次荧光（用化学染色） 非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），以便进行观察。对特定物体选择合适的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别出来而可以观察到。

8. 荧光显微镜 抗体荧光技术（用免疫染色） 利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。

9. 荧光显微镜 荧光显微镜的原理

10. 荧光显微镜 光源：光源辐射出各种波长的光。 由于荧光和激发光相比，是非常微弱的，因此荧光显微镜的光源强度必须很高，即使在近紫外区，也必须有足够的强度。为了满足这些要求，通常采用高压汞灯，但有时为了特殊需要，也采用卤素灯。

11. 荧光显微镜 荧光激发滤色块 透过能使标本产生荧光的特定波长的光，同时阻挡对激发荧光无关的光。 几种主要的荧光激发滤色块

12. 荧光显微镜 荧光标本： 一般用荧光色素染色或免疫荧光的方法。 阻挡滤光镜： 阻挡掉没有被标本吸收的激发光，有选择地透射荧光。在荧光中也仅有部分波长被选择透过。

13. 荧光显微镜 光学暗视场： 通常荧光的强度和激发光相比，是极微弱的，如果荧光和激发光相叠加，反差就会极度减弱。因此，必须把激发光和荧光彻底地分离出来。

14. 荧光显微镜 荧光显微镜的分类： 一.透射荧光显微镜： 光源：高压汞灯或卤素灯。 聚光镜：使用暗场聚光镜，使激发光和荧光分离出来。 物镜：可用任何种类的物镜。 标本：因为是透射观察，薄的标本比较适合。

15. 荧光显微镜 透射荧光显微镜 优点： • 由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。 • 由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。 • 用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。

16. 荧光显微镜 透射荧光显微镜 缺点： • 必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧光像。 • 由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。 • 视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。 • 厚的或不透明的标本不适用。

17. 荧光显微镜 反射荧光显微镜 的光学原理

18. 荧光显微镜 荧光显微镜的分类： 二.反射荧光显微镜： 光源：高压汞灯或卤素灯。 聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需要聚光镜。 物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外光，而且本身不产生荧光，对数值孔径没有限制。 标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。

19. 荧光显微镜 反射荧光显微镜 优点： • 由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。 • 采用柯拉照明法，可利用孔径光阑和视场光阑的效果。 • 物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高分辨率的像。 • 厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。 • 其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。 • 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。

20. 荧光显微镜 反射荧光显微镜 缺点： • 在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须用大数值孔径的物镜。 • 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。

21. 荧光显微镜 荧光显微摄影技术 • 选用正确的激发滤色块 • 采用柯勒照明法 • 曝光时一般采用1%点测光 • 摄影采用高感度软片

22. 荧光显微镜 荧光显微摄影技术 • 荧光有衰退的特性 • 视场光阑和光闸的使用 • 照相系统的使用 • 标本和底片的正确保存

23. 荧光显微镜 荧光显微数码摄影技术 • 需特殊的设备。 • 一般用手动曝光。

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