5.2 酵母菌的基因工程

1. 5.2 酵母菌的基因工程

2. 发展历程 • 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。 • 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。 • 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。 • 我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。 • 1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。

3. 酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于： • 安全无毒，不致病； • 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； • 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率； • 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； • 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。 缺陷在于： • 表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工修正。

4. 5.2 .1 酵母菌的宿主系统 • 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 • 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 • 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌

5. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括： 酵母属 如酿酒酵母 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想

6. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变

7. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。抑制超糖基化作用的突变宿主菌许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。 酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。

8. 靶蛋白 Ubiquitin 76 aa Lys Lys HOOC Ubiquitin ligase E3 靶蛋白 Lys Ubiquitin ligase E3 靶蛋白 Lys 蛋白酶体 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用

9. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体。 UBA1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解。 Ubc4-ubc5双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。

10. 5.2.2 酵母菌的载体系统 载体的一般结构 选择标记 复制子 表达盒 启动子 先导序列 终止子 有用的蛋白结构域 1酵母菌中的野生型质粒 2酵母菌克隆表达质粒的构建

11. 酿酒酵母中的2μ环状质粒 几乎所有的酿酒酵母都含有2μ双链环状质粒，拷贝数维持50-100个。 Irs反向重复序列600bp，重组FLP编码产物驱动Irs的同源重组REP编码产物控制质粒的稳定性STB REP的结合位点 接合酵母属中的pSRI、pSR1、pSB2和pSR1以及克鲁维酵母属中的pKD1质粒等，均有类似的结构。 酵母菌种的野生型质粒

12. 乳酸克鲁维酵母中的线性质粒 乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100个，分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的毒素蛋白基因。 酵母菌种的野生型质粒

13. 酵母菌克隆表达质粒的构建 含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建 • ARS为酵母菌中的自主复制序列，大小在0.8-1.5Kb,染色体上每30-40bp就有一个ARS元件。 • 由染色体ARS构成的质粒称为Yrp，而由2μ质粒构建的杂合质粒为Yep。 • 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达200个，但是经过几代培养后，质粒丢失率达50%-70%，主要由于分配不均匀所致。

14. 酵母菌克隆表达质粒的构建 含有CEN的YCp质粒的构建 • CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列。将CEN插入到ARS质粒中，获得的新载体称为YCp。 • YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数通常只有1-5个。

15. 酵母菌克隆表达质粒的构建 含有TEL的YAC质粒的构建 • 利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元件构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大片段的外源DNA，这是构建YAC载体的基本思路 • YAC载体的装载量可高达800kb，适用于构建人的基因组文库。

16. 5.2.3 酵母菌的转化系统 • 酵母菌的转化程序 • 转化质粒在酵母细胞中的命运 • 用于转化子筛选的标记基因

17. 酵母菌的转化程序 酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质球转化法。在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%。但是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。 原生质转化法德一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化的原生质占转化子总数的25%-33%。

18. 酵母菌的转化程序 碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG热休克处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有以下特性： • 吸收吸收线性DNA的能力明显大于环状DNA，二者相差80倍。 • 共转化现象较为罕见。

19. 酵母菌的转化程序 酵母菌电击转化 • 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较大的负作用。其优势在于不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件适用范围广，而且转化率高达105转化子/μgDNA。

20. 转化质粒在酵母细胞中的命运 • 单双链DNA均可高效转化酵母菌，但单链DNA的转化率是双链的10-30倍 • 含有酵母复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制。 • 不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体，这对于体内定点突变酵母基因组极为有利。 • 同源重组的频率取决于整合型质粒与受体菌基因组之间的同源程度以及同源区域长度，一般来说，整合子占转化子总数的50-80%。

21. 用于转化子筛选的标记基因 营养缺陷型的互补基因 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要由营养缺陷型互补基因和显性基因两大类。 营养缺陷型互补基因主要由氨基酸和核苷酸生物合成记忆如：Leu 、Trp、 His、 Lys、 Ura 、Ade。 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难。

22. 用于转化子筛选的标记基因 显性标记基因 显性标记基因的编码产物只

23. 5.2.4 酵母菌的表达系统 • 酵母菌启动子的基本特征和选择 • 酵母菌启动子的可调控表达系统 • 外源基因在酵母菌中表达的限制因素 • 酵母菌表达系统的选择

24. 酵母菌启动子的基本特征和选择 • 用于启动转录蛋白质结构基因的酵母菌Ⅱ型启动子由基本区和调控区两部分组成，基本区包括TATA盒和转录起始位点。 • 调控区位于基本区上游几百碱基对的区域内，由上游激活系列（UAS）和上游阻遏序列（URS）等顺式元件组成。 • 利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中克隆和筛选具有特殊活性的强启动子，另一种方法是从已有的启动子中构建杂合启动子

25. （1）温度控制性启动子 酿酒酵母有a和α两种单倍体，分别由MATa和MATα两种等位基因决定。 MATα由顺反子MATα1和MATα2组成，前者决定α1的激活过程，后者决定α2阻遏过程。 MATa中，a1和a2蛋白共同决定a1- a2阻遏。 受体细胞基因组 A 25℃ Sir3-8ts a1 MATa hmlα2-102 Sir3-8ts a1 hmlα2-102 MATa α1 重组质粒 a型启动子 α型启动子 a型启动子 α型启动子 酵母菌启动子的可调控表达系统

26. 酵母菌启动子的可调控表达系统 （2）超诱导型启动子 当酿酒酵母生长在无半乳糖或葡萄糖存在的培养基时，其GAL1、 GAL7、 GAL10启动子受到阻遏；加入半乳糖或者葡萄糖时，启动子活性被诱导1000倍。

27. 酵母菌启动子的可调控表达系统 （3）严紧控制表达系统 一种以人雄激素受体为中心的严紧控制表达系统能有效地将外源基因的表达水平控制在一个合适的范围，以弥补酿酒酵母的宿主-载体系统缺少的严紧控制表达机制

28. 外源基因在酵母菌种表达的限制性因素 • 外源基因稳态mRNA的浓度 • 外源基因mRNA的翻译活性 • 酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH，磷酸甘油激酶PKG，乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的氨基酸是由25个密码子编码的。

29. 酵母菌表达系统的选择 酿酒酵母表达系统 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得有些重组蛋白与受体细胞紧密结合，而不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。

30. 酵母菌表达系统的选择 乳酸克鲁维酵母表达系统 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的搞笑表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也能稳定遗传40代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌性的重组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。

31. 酵母菌表达系统的选择 巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性事巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。

32. 酵母菌表达系统的选择 多型汉逊酵母表达系统 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。 目前，包括乙型肝炎表卖弄抗原在内的数种外源蛋白在该系统中成功表达。

33. 酵母菌的蛋白修饰分泌系统 • 蛋白质的分泌运输机制 • 信号肽及其剪切系统 • 分泌型蛋白的糖基化修饰

34. 泡囊 核膜 质膜 高尔基体 内质网膜 蛋白质的分泌运输机制酵母菌的蛋白质分泌系统 与其他高等真核生物相似，高度分化的细胞器结构在酵母菌蛋白分泌运输过程中起着重要作用。

35. 信号肽及其剪切系统 与其他真核生物相似，酵母菌信号肽序列的保守性较低，大都由15-30个氨基酸残基组成，含有三个不同的结构特征，即N端带正电荷的n区，中间疏水残基的h区，C端极性的c区。 • n区的长度及氨基酸残基性质各异，都含正电荷。 • h区的疏水氨基酸残基大都随即排列。 • c区具有对应于信号肽剪切位点的特征序列。

36. 分泌型蛋白的糖基化修饰 酵母菌中的蛋白质糖基化修饰有两个主要步骤，即在内质网内腔中的寡聚多糖核装配以及在高尔基体中的糖外链延伸。 • 进入高尔基体的分泌型蛋白在其寡聚多糖核上进行外链的延伸反应。 • 酵母菌的修饰形式不同于高等真核生物。 • 重组异源蛋白在酵母菌受体细胞中的超糖基化会造成重组蛋白的生物活性降低以及蛋白质的免疫原性增加等。

37. 利用重组酵母生产乙肝疫苗 • 乙肝肝炎病毒的结构与性质、 • 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 • 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母

38. 乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染能力的病毒颗粒，直径42nm，基因组仅为3.2kb。病毒的主要结构蛋白石病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化和非糖基化两种形式，颗粒内的蛋白成分包括核心抗原、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。

39. 乙型肝炎病毒的结构与性质 乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因

40. 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均颗粒直径为22nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。 目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒以作为乙肝疫苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。

41. 整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建

42. 利用重组酵母生产人血清蛋白 人血清蛋白是血浆的主要成分，由肝脏合成，并分泌到血液循环系统中，然后散布于大多数体液中。 • 最初采用的重组人血清蛋白表达分泌系统是酿酒酵母。 • 进一步的改进方法是使用乳酸克鲁维酵母作为受体细胞，该菌体杀手毒素蛋白α的信号肽能大大提高表达产物的分泌效率。 • 巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良的重组人血清蛋白的表达分泌系统。