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C A U. Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR-Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme von Milchsäurebakterien. Von Christian Stelter. Überblick. „Subtraktive Hybridisierung“ Ziel der Methode? Welche Vorteile?

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Presentation Transcript

  1. C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

  2. Entwicklung stammspezifischer PCR-Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme von Milchsäurebakterien Von Christian Stelter

  3. Überblick • „Subtraktive Hybridisierung“ • Ziel der Methode? • Welche Vorteile? • 2. Prinzipieller Ablauf der Methode • Praktische Ergebnisse • Ausblick

  4. Entwicklung „Subtractive Hybridization“ als Basis, um • genetische Unterschiede zu identifizieren. Identifizierung von Genaktivität für • Embryonalentwicklung • Krebsentstehung Identifizieren von Unterschieden im Genom • verschiedener Stämme von Bakterien • komplexer eukaryotischer Lebewesen

  5. Biotechnologie in menschlichen Kulturen • unkontrollierte Fermentation • 6000 v. Chr. Alkoholische Getränke im Zweistromland Milchwirtschaft durch Nomaden in Zentralasien Ziel: Konservierung und Veredelung von Lebensmitteln

  6. Notwendigkeit zur Diagnose • genetische Identität • Stabilität von Starterkulturen • hygienische Risiken • wirtschaftliche Effizienz routinemäßige Verifikation durch genetische Fingerabdrücke

  7. Notwendigkeit zur Diagnose • Fingerprinting

  8. Notwendigkeit zur Diagnose • Verständnis probiotischer Eigenschaften

  9. Anwendbarkeit der SSH Genomische Unterschiede identifizieren/isolieren Um darauf aufbauend a) Funktion der unterschiedlichen DNA zu analysieren b) PCR-basierende Nachweissysteme zu erstellen c) Eigenschaften in weiteren MOs zu detektieren

  10. Subtraktive Hybridisierung dominante Quelle der genomischen Variation: Insertionen oder Deletionen großer (10 bis 50 kb) DNA-Regionen

  11. Subtraktive Hybridisierung gezielte Identifikation von Unterschieden besonders vorteilhaft

  12. Subtraktive Hybridisierung

  13. Subtraktive Hybridisierung

  14. Subtraktive Hybridisierung Ausgangs- material

  15. Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Fragmentieren

  16. Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Mischen

  17. Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Denaturieren

  18. Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Hybridisieren

  19. Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Isolieren

  20. wichtige Entwicklungsschritte Entwicklungen innerhalb der „Subtraktiven Hybridisierung“ betrafen die Isolierung der stammspezifischen, einzelsträngigen DNA a) Immobilisierung b) Suppression Effekt

  21. Isolierung durch Immobilisierung Immobilisierte Subtraktor-DNA

  22. Isolierung durch Immobilisierung Zugegebene, denaturierte Proben-DNA

  23. Isolierung durch Immobilisierung Homologe DNA-Fragmente werden dem Überstand entzogen

  24. Suppression Subtractive Hybridization • Verwendung von Adaptoren • Vorteile: • Geringste Mengen • 2) Suppression Effekt

  25. Suppression Effekt

  26. Vorteile der SH/SSH • Geringe Materialanforderungen (PCR) • bis zu 96% der Unterschiede identifizierbar • Verzicht auf die Sequenzierung vollständiger Genome • Reduktion des zeitlichen und finanziellen Aufwandes

  27. Bisherige Anwendung Genomanalysen im medizinischen Bereich: • Identifikation von Virulenzgenen • neuartigen Restriktions-Modifikationssystemen • Antibiotikaresistenzen • Oberflächenstrukturen • PAIs: „pathogenicity islands“

  28. Praktische Ergebnisse Anwendung auf Milchsäurebakterien Lactococcus St. 1760-1526 Lactococcus St. 1526-1760 • Isolierung der unterschiedlichen Regionen: • Funktionen der unterschiedlichen Regionen • Stammspezifische PCR-Systeme • Suche nach Eigenschaften in anderen MOs

  29. Anreicherung stammspezifischer Fragmente 1526 – 1760 = ? 1760 – 1526 = ?

  30. Gefundene Unterschiede Lactococcus Stamm 1760 • A2: Bacteriocin-Produktion • A5: Funktion unbekannt Lactococcus Stamm 1526 • A22: zellwandassoziierte Proteinase • A23: Restriktionsmodifikationssystem [subunit (hsdS) gene]

  31. PCR-Systeme auf die verwendeten Stämme A2: Nisin A5: ? A22: Proteinase A23: hsdS Nisin Proteinase hsdS ? 1526 1760

  32. PCR-Systeme auf weitere Stämme 89 bp: ? 166 bp: Proteinase 271 bp: hsdS 322 bp: Nisin

  33. Weitergehende Anwendungen Identifizieren von probiotischen Eigenschaften • größere Überlebensrate • dauerhafte Ansiedlung • Reduktion von mutagenen Enzymen • Stimulation von Makrophagen Identifikation von gentechnisch veränderten Organismen ehemalige Systementwicklung: Reaktionen auf Stress

  34. Danke Danisco Cultor Niebüll GmbH Dr. Udo Friedrich PD Dr. Winfried Hausner

  35. Noch Fragen? Wir haben einen Überschuss an einfachen Fragen und einen Mangel an einfachen Antworten. Lothar Schmidt

  36. Immer noch Fragen? Gott weiß alles, sagt es aber nicht. Ich weiß nichts und sage alles. unbekannt

  37. Suppression Subtractive Hybridization

  38. Suppression Subtractive Hybridization

  39. Suppression Subtractive Hybridization

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