第六章染色體型態

第六章染色體型態 • 大綱 • 真核細胞染色體結構 • DNA如何捆成染色體 • 染色體的的外表型態 • 異染色質與真染色質 • 條紋技術

真核細胞染色體結構(Eukaryotic chromosome structure) • 真核遺傳物質的組成 • 細胞核內的染色體的組成包含 • DNA：雙股線狀 • 蛋白質：蛋白質包括組織蛋白(histone)與非組織蛋白(non-histone) ，其中DNA與蛋白質重量約相等 • RNA • 細胞質內的遺傳物質有粒線體DNA與葉綠體DNA均為雙股環狀 • 每一條染色體含一個DNA分子

組織蛋白(histone protein) • 組成富含兩種帶正電的胺基酸 • 精胺酸(arginine) • 離胺酸 (lysine) • 20 ～ 30% 帶- NH3 +group ，故帶正電 • histone的種類可分為HI、H2a、H2b、H3、H4五種。 • histone的功能 • 穩定DNA結構： histone屬酸性，帶正電，當它們與DNA (含磷酸根，帶負電)結合，可以形成穩定結構 • 促使DNA的纏繞(Coiling) : DNA捆綁histone經纏繞使染色絲的半徑由2 nm增加到30 nm • 為一種保守性的蛋白質，不同生物間，組織蛋白相似性很高，如牛與碗豆的H4蛋白序列很類似，二者僅相差一個胺基酸

非組織蛋自(nonhistone protein) 具有幾個特性 • 構造差異大(structural diversity) nonhistone proteins由20種以上的蛋白質組成，稱為異質蛋白質(heterogeneous proteins) • 組織專一性(tissue specificity) 在同一生物體內，隨細胞的種類不同，非組織蛋白的組成也不同 • Nonhistone protein參與的反應 • DNA複製、修補、基因表現有關的蛋白質 • 例如 DNA聚合酶、RNA聚合酶 • 包含染色體收縮有關的蛋白質，例如收縮蛋白( condensins )、拓樸異構酶( topoisomerase) • 染色體除去組織蛋白質， DNA會鬆散開，留下一堆非組織蛋白的結構稱為鷹架( Scaffold)

中心節(centromere) • 真核染色體緊密收縮處，在有絲分裂或減數分裂時，參與染色體的移動 • 中心節是紡鍾絲與染色體的接觸點，紡鍾絲收縮，使染色體向兩極移動 • 人類的中心節區包含一段約170鹼基對重複序列，稱為α衛星 (alfa satellite)。隨染色體不同，重複次數約5000-15000次 • 酵母菌的中心節 • 中心節DNA長約220 bp直接與紡鍾絲相連，對DNase具抗性，不會被DNase分解 • 中心節內包含四區CDE1, CDE2, CDE3, CDE4。不同的中心節， CDE4變化較大， CDE2富含AT • 真核的中心節(fig:6-2) • 一般真核的染色體是酵母菌的100倍 • 真核中心節含大量的異染色質(heterochromatin) ，內含重複的衛星DNA satellit DNA的功能未知，不會轉錄 • 人類的衛星DNA有一種稱alphoid family是一段171 bp前後重複的圖案( motif) ，全長有三萬bp • 別的靈長類也有類似的motif，只是每一種的序列與重複次數不同

酵母菌的中心節結構

端粒(telomere) • 端粒的特性 • 具一小段端粒DNA約5-8 bases 前後重複多次 • 端粒DNA 序列及重複次數隨生物種類不同而不同 • 哺乳類及人類為 5‘TTAGGG3’ ，重複250-1000次 • Tetrahymena為5'TTGGGG3‘ • 果蠅，內含轉移子( transposable element) • 端粒可保護染色體端點，防止染色體被外切酶(exonuclease) 切斷，並輔助染色體端點DNA的複製。

端粒的形成 • 染色體複製時，藉端粒酶( telomerase )可將特殊的端粒序列加到染色體上 • 若缺乏端粒酶複製後染色體會變短 • 單細胞的真核生物具端粒酶：例如酵母菌就可以一直分裂 • 人類的生殖細胞具端粒酶可一直分裂 • 分化後的體細胞缺乏端粒酶，隨細胞分裂端粒會愈來愈短，細胞漸老化，到一個程度細胞不再分裂 • 端粒有如一種內在時鐘計算細胞的年齡 • 癌細胞具telomerase細胞可以一直分裂，端粒不會變短。

DNA如何捆成染色體 • 染色體收縮 • 每一條染色體含DNA分子，組成人類的46條染色體的DNA全部總長約有兩公尺 • 平時DNA捆綁組織蛋白形成染色絲( chromatin fiber) • 染色絲存在約5-10 µm的細胞核內，細胞分裂時，為了讓染色體方便移動，染色絲收縮成更短，人類最長的一條染色體只有2 µm，DNA全長85000 µm • 核仁小體(Nucleosome) • 染色絲(chromatin)在電子顯微鏡下，呈『線串珠』 (beads-on a-string)的構造。珠(beads)為染色絲次單位，或稱為核仁小體。

核仁小體 • 約含200鹼基對(bp)包含H2a、H2b、H3，H4各兩個組成的八位體(octamer) • 核心粒子(core particle) • 146 bp的核心DNA纏繞八位體組織蛋白，共繞l又3/4圈 • 連接核仁小體間的DNA稱為連結DNA (linker DNA) • 完整的核仁小體還包含一個H1， H1是位在linker DNA上 • H1的作用: 可能是穩定環繞在八位體外的DNA超螺旋結構 • 可能參與染色絲的纏繞 • 可能參與調節基因的表現。

染色絲次單位(chromatin subunit) • 次單位是由核仁小體核心(core) ，連接核仁小體間的連結DNA (linker DNA) ， H1與非組織蛋白組成 • Linker DNA的長短，隨細胞種類而異，約有8 - 114 bp。而core DNA的長短都固定是I46 bp • 30 nm染色絲纖維(chromatin fiber) • 電子顯微鏡下所觀察的中期染色體，是由纖維狀構造經摺疊纏繞成(圖6-4) • 平均直徑30 nm，核仁小體的直徑 11 nm，故染色絲是由核仁小體再摺疊，纏繞成的 • 由DNA捆綁到染色體形成是經由三個階段的收縮 • DNA (寬2 nm)捆綁組織蛋白形成核仁小體，產生直徑約11 nm的核仁纖維，組織蛋白H2a、H2b、H3、 H4各兩個參與核仁小體的形成。

11 nm核仁纖維再經摺疊(folding)、螺旋(coiling)形成30 nm 的染色絲纖維， H1參與此超螺旋形成過程，染色絲纖維，稱為螺線管(solenoid) • 非組織蛋白產生一個架構，參與30 nm染色絲纖維再緊密摺疊捆成中期染色體 • 核酸酶超敏感區(nuclease hypersensitive site) • 真核DNA有些無nucleosome處，對不同的核酸梅特別敏感 • 該處DNA參與複製、轉錄及其它作用 • 人類許多DNA的起動子(promoter)是位在核酸酶超敏感區內。超敏感區可能存在基因前，基因內或基因後。

黏著蛋白( cohesins )與收縮蛋白( condensins ) • 黏著蛋白( cohesins) • 具有多個次單位，可將兩條染色分體黏在一起，直到細胞分裂後期才分開 • 收縮複合體( condensins) ： • 協助染色絲收縮的蛋白質。M-CDK會使condensins發生磷酸化而變成具有活性，藉由ATP水解產生的能量使DNA超螺旋化( supercoiling) 並收縮造成染色體收縮 • Condensins是一個大分子蛋白質複合體，中央為關節區可伸縮，端點為球狀區可與DNA結

染色絲整修( Chromatin remodeling) • 組織蛋白修飾→組織蛋白的N端為長條尾端由核仁小體的核心伸出 • 協助30 nm 染色絲織維的形成 • 與不同的化學基產生共價鍵結，造成染色絲整修 • 染色絲鬆散或收縮→造成DNA複製、基因表現 • 有的發生核仁小體的位置改變 • 染色絲整修是種超越基因的機制( epigenetic mechanism) ， • 即是利用修飾方式來控制基因的活性 • 不同的組織蛋白有不同的修飾方式 • 乙醯基化( acetylation)：組織蛋白藉由乙醯基轉化酶( histone acetyltransferase )的作用在離胺酸( lysine)上加上乙醯基 • 使染色絲纖維打開，釋出histone， DNA鬆散開來可複製或表現 • 哺乳動物的巴氏體是X染色體緊密收縮成的，主要是因其組織蛋白H4未乙醯基化

甲基化( methylation) ：組織蛋白的精胺酸( arginine)與離胺酸( lysine)上加上甲基( CH3) ，會使染色絲纖維更緊密，造成基因關閉 • 磷酸化( phosphorylation)：:組織蛋白的絲胺酸( serine)或組胺酸( histidine )的-OH基上發生磷酸化，使histone帶負電 (特別是H3 )，造成染色絲纖維打開，基因活化 • 染色體的外表型態(Gross morphology of chromosome) • 染色體外表型態隨細胞週期而改變，本節主要討論中期染色體(metaphase chromosome) • 鑑定染色體主要依據：染色體的長度與中心節的位置。一般染色體的大小: 0.5-30 µm

幾個與染色體有關重要的名詞 • 染色體臂分為 • p arm：短臂(short arm) • q arm：長臂(long arm) • 染色體依中心節所在位置分為 • 中央中節(metacentric chromosome)：中心節在正中央 • 近中央中節(submetacentric chromosome)：中心節偏中央 • 近端中節(acrocentric chromosome) :中心節接近一端 • 端點中節(telocentric chromosome) :中心節在端點 • 染色體依中心節數目分為 • 無中心節染色體(accentric chromosome) 不帶中心節的染色體 • 雙中心節染色體(dicentric chromosome) 具有兩個中心節的染色體。

初級收縮區(primary constriction) • 中心節存在的位置 • 次級收縮區(secondary constriction ) • 有的染色體，除了有初級收縮區之外，尚有另一段收縮區，其後又附有一段染色體稱為衛星區(satellite) (圖)。 Secondary constriction (1934 McClintock發現) • 又稱核仁組成中心( NOR, nucloeolar organizer regio • 參與核仁(nucleolus)的形成 • 它也是一段染色質(chromatin)繞成的，所帶的基因是參與核糖體RNA (ribosomal RNA)的合成。

衛星染色體(satellite chromosome) • 具有衛星區(satellite)的染色體稱之 • 幾乎所有生物細胞內，至少有一對衛星染色體，如人類就有5對 • 衛星區(satellite)通常是附在染色體的短臂，它的大小不等 • 染色粒(chromomere) 真核染色體在有絲分裂或減數分裂時，染色絲收縮出現的暗區 • 核仁(Nucleolus) • 組成由核內的RNA &蛋自質組成，外面無膜 • 功能是rRNA的合成， rRNA與蛋白質結合產生核糖體

rRNA基因的位置 • 真核5.8S, 18S、28S rRNA的基因稱為Rdna • 位在染色體的次級收縮區(secondary constriction， nucleolar organizer) • 人類細胞10條衛星染色體的次級收縮區內各有一段製造rRNA的DNA，此段DNA形成環狀構造(loop)伸入核仁中，故這些rRNA是在核仁中形成(圖) • 染色體鑑別方法 • 染色體大小 • 中心節所在位置 • 染色時所出現的條紋型(banding pattern)。

染色體圖(Karyotype) • 將細胞內所有的中期染色體照相拍下，剪下染色體，依染色體的大小，中心節的位置，由大而小排列出來的圖 • 染色體圖技術(Karyotyping)：將一個中期細胞染色體以照相拍下，然後把所有的染色體剪下，成對排列，長的排在前面，短的排在後面，最長的一對，稱為第一對染色體，依次排列，如果染色體大小很接近，不易區分，再依照條紋技術(banding technique)區分 • 染色體圖的價值 • 鑑定染色體是否正常做為鑑定人類遺傳疾病的工具 • 染色體圖可做分類的依據，品種、品系鑑定 • 鑑定多倍體，單倍體，異倍體等

人類染色體圖(Human karyotype)分成7組(groups) • A組(染色體第1一3對) • B組(染色體第4-5對) • C組(染色體第6-12對及X)每一對很相像，很難直接鑑定 • D組(染色體第13-15對) ，三對均具有衛星體(satellite) • E組(染色體第16-18對) • F組(染色體第19-20對) • G組(染色體第21-22對) ，兩對均具有衛星體 • 第一對染色體最長，第22對最短。

異染色質又分為 • 基本異染色質(constitutive heterochromatin) • 人類染色體，基本異染色質位在中心節附近，其它哺乳動物細胞的基本異染色質有的位在染色體臂上 • 它們一直緊密收縮，該處的基因不會表現，富含衛星DNA • 偶發異染色質(facultative heterochromatin) • 生物發育某時期會變成真染色質，該處的基因會表現 • 染色體的伸縮與基因表現，有何關係? • 染色體收縮緊密時，基因不表現，染色體放鬆時，基因才會表現 • 通常是細胞不分裂時，染色體鬆散，基因才會表現。真染色質是隨細胞週期的變化而收縮或放鬆。

條紋技術(Banding technique) • 要鑑定染色體，如果只依染色體的長度及中心節的位置，很難區分 • 某些染色體的長度，外型很像，很難分出是第幾對 • 1970年代發展出條紋的方法，對細胞遺傳的研究有很大的貢獻 • 條紋技術是將已附著在切片上的染色體，經過酸、鹼、熱、鹽類、酵素、染料等處理，然後染色，放在顯微鏡下觀察，呈現深淺不同的條紋(band) • 每一對染色體由於DNA和蛋白質的結合不同，出現的條紋型的(banding pattern)也不同 • 此法有助於鑑定每一條染色體，並可與正常的染色體比較，鑑定出染色體內是否有不正常的變化

條紋技術的種類 • C band、G band、Q band、R band • C band • C代表基本異染色質(constitutive heterochromatin) ，染色較深的條紋是基本異染色質部份， • 出現在中心節附近及染色體的尖端 • 可用來鑑定哺乳動物的Y染色體，因為Y染色體整條都是異染色質，經C banding技術處理，很快可以鑑別出Y染色體 • G band • G代表用金沙染料染色(Giemsa staining) • 先經鹼性鹽溶液及酵素處理，再用Giemsa染色，條紋型代表染色粒的排列 • 醫院常用G-band來檢查人類遺傳疾病 • 共識：將每一條染色體分為短臂、長臂，每一臂依條紋出現位置，再分隔為不同區 • 有的內部再細分隔為更小區，每一條染色體上每一個條紋都可有一定的命名，以方便辨識

Q band • Q代表螢光染料Quinacrine mustard • 染色體先用quinacrine染色後，於螢光顯微鏡下（UV），出現螢光條紋，背景是暗的 • R band • R代表與G band相反(reverse to G bands) • G band 染色深的部位，在R band是淺的。通常是用高溫，低pH處理 • 為真染色質區，R band沒有G band清晰，較少用來鑑定染色體 • 助於研究染色體的結構，尤其是染色體的尖端部位染得很清楚，可用來鑑定染色體是否發生端點缺失(terminal deletion)。

條紋技銜的價值 • 助於做染色體圖(karyotyping)：每一對染色體有獨特的條紋型式，經條紋技術處理後較易區分 • 助於研究染色體內部的變化：染色體若發生倒轉(inversion) ，易位(translocation) ，缺失 (deletion)等，由條紋型的變化，很容易判斷出來 • 助於演化上的研究：比較不同生物染色體的條紋型式，可以研究演化上的關係 • 助於決定基因圖(gene mapping)的研究 • 人類的染色體約可做出900 bands，若某人缺乏某種酶，做條紋技術分析，若發現染色體缺乏某一條紋，便可推出製造該酶的基因是位在該條紋上 • 纖維囊腫病變( cystic fibrosis)基因位在染色體7的長臂 : q21 & q31之間。全長25萬bases大部份為非密碼區，真正密碼區只佔2% • 肌肉萎縮症Dmd基因位在X染色體短臂『Xp21』全長200萬bp，其中大部份為intron，密碼區只佔1% ' 大部份病人是dmd基因內幾個bases改變，少數是因dmd 基因完全缺失或部份缺失。

第六章 染色體型態