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Biologie Moléculaire

Biologie Moléculaire. Compétences Techniques. Compétences. Micropipetage Préparation de solutions Travailler avec les concentrations Dilutions Quantités Électrophorèse sur gel d’agarose. 2-20 µL 50-200 µL 100-1000 µL Max. 0.02 mL 0.2mL 1mL.

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Biologie Moléculaire

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Presentation Transcript

  1. Biologie Moléculaire Compétences Techniques

  2. Compétences • Micropipetage • Préparation de solutions • Travailler avec les concentrations • Dilutions • Quantités • Électrophorèse sur gel d’agarose

  3. 2-20 µL 50-200 µL 100-1000 µL Max. 0.02 mL 0.2mL 1mL Micropipetage- Mesurer de petits volumes • Permet la mesure de microlitres (µL) • 1 000 X moins que 1 millilitre

  4. Réglage du volume- P20 Dizaines (0, 1=10 or 2=20) Unités (0-9) Décimale (1-9 = 0.1-0.9)

  5. Réglage du volume- P200 Centaines (0, 1=100 ou 2=200) Dizaines (0, 1-9=10-90) Unités (1-9)

  6. Réglage du volume - P1000 Milliers (0, 1=1000) Centaines (0, 1-9=100-900) Dizaines (0, 1-9=10 - 90)

  7. Étape 3 Insérer embout dans la solution a être prise Étape 1 Insérer embout Étape 2 Peser piston jusqu’au Premier arrêt Étape 5 Retirer pipetteur Utilisation du micropipetteur Étape 4 Aspirer l’échantillon en relâchant lentement le piston

  8. Livraison Commencer à livrer 1er arrêt =livrer 2e arrêt = expulsion

  9. Directives pour reproductibilité optimale • Utiliser le pipetteur dont le volume se rapproche le plus de celui désiré • VITESSE et FORCE consistante pour peser et relâcher le PISTON • PROFONDEUR D’IMMERSION consistante • 3-4mm sous la surface • EVITER les bulles d’airs • Ne jamais aller au-delà des limites du pipetteur

  10. Préparation des Solutions

  11. Définitions • Solution • Mélange de 2 substances ou plus dans une phase unique • Solution composée de deux composantes • Soluté • Partie qui est dissoute ou diluée – Habituellement la plus petite quantité • Solvant (OU Diluent) • Partie de la solution dans laquelle le soluté est dissout – Habituellement le plus grand volume

  12. Concentration = Quantité de soluté Quantité de solution (Pas solvant) Trois façons d’exprimer les concentrations: Concentration Molaire (Molarité) Pourcentages Masse par volume Concentrations

  13. Molarité • No de Moles de soluté/Litre de solution • Masse de soluté/PM de soluté = Moles de soluté • Moles de soluté/vol en L de solution= Molarité

  14. Pourcentages • Les concentrations en pourcentage peuvent être exprimé en tant que : • V/V – volume de soluté/100 mL de solution • M/M – Masse de soluté/ 100g de solution • M/V – Masse de soluté/100 mL de solution • Tous représentent des fractions de 100

  15. Pourcentages (suite) • %V/V • Ex. 4.1L soluté/55L solution =7.5% • Doit avoir les mêmes unités en haut et en bas! • %M/V • Ex. 16g soluté/50mL solution =32% • Dois avoir des unités du même ordre de grandeur en haut et en bas! • % M/M • Ex. 1.7g soluté/35g solution =4.9% • Dois avoir les mêmes unités en haut et en bas!

  16. Les Dilutions La Réduction d’une Concentration Une Fraction

  17. Dilutions • Dilution = produire des solutions plus faibles à partir de solutions plus fortes • Exemple : Faire du jus d’orange à partir de concentré. Mélanger une cannette de concentré de jus d’orange congelé avec trois (3) cannettes d’eau

  18. Dilutions (suite) • Les dilutions sontexpriméescomme le volume de la solution étantdiluée par le volume total final de la dilution • Dansl’exemple du jus d’orange, la dilution seraitexpriméecomme 1/4, pour unecannette de jus à un TOTAL de quatrecannettes de jus dilué. Quand on parle de la dilution, vousdiriez pour l’exemple du jus : « un dansquatre ».

  19. Dilutions (suite) • Un autre exemple : • Si vous diluez 1 ml de sérum avec 9 ml de salin, la dilution serait écrite 1/10 ou dite « un dans dix », car vous exprimez le volume de la solution étant diluée (1 ml de sérum) par le volume final TOTAL de la dilution (10 ml totaux).

  20. Dilutions (suite) • Un autre exemple : • Une (1) partie d’acide concentré est diluée avec 100 parties d’eau. Le volume total de solution est 101 parties (1 partie d’acide + 100 parties d’eau). La dilution est écrite comme 1/101 ou dite “un dans cent un ”.

  21. Dilutions (suite) • Remarquez que les dilutions n’ont pas d’unités (cannettes, ml, ou parties) mais sont plutôt exprimées comme un nombre par rapport à un autre nombre • Exemple : 1/10 ou « un dans dix»

  22. Dilutions (suite) • Les dilutions sont toujours exprimées avec la substance originale étant diluée comme étant un (1). Si plus d’une partie de la substance originale est initialement utilisée, il est nécessaire de convertir la partie de la substance originale à un (1) quand la dilution est exprimée.

  23. Dilutions (suite) Exemple: Deux (2) parties d’un colorant sontdiluées avec huit (8) parties de diluant. Le volume total de solution est 10 parties (2 parties de colorant + 8 parties de diluent). La dilution estinitialementexpriméecomme 2/10, mais la substance originaledoitêtreexpriméecommeétant un (1). Pour convertir le volume original à un (1), utiliseruneéquation de rapport et de proportion. Rappelez-vousque les dilutions sontexprimées en terme de 1 à quelque chose : __2 parties de colorant = ___1.0___ Volume total de 10 parties x 2 x = 10 x = 5 La dilution estexpriméecommeétant 1/5.

  24. Dilutions (suite) La dilution n’est pas toujourscomme des nombresentiers. Exemple: Deux parties (2) de sang sontdiluées avec cinq (5) parties de saline. Le volume total de solution estsept (7) parties (2 parties de sang + 5 parties de saline). La dilution serait 2/7, ou plus précisément 1/3.5. Encore unefois, ceciestcalculé en utilisantuneéquation de rapports et de proportions. Rappelez-vousque les dilutions sontexprimées en terme de 1 à quelque chose: __2 parties de sang_____ = ___1.0___ Volume total de 7 parties x 2 x = 7 x = 3.5 La dilution estexpriméecomme 1/3.5

  25. Qu’est que cela veut dire?? • Si une solution possèdeune dilution de 1/10 le nombrereprésente 1 partie de l’échantillonajouté à 9 parties de diluant. • Si cette solution étaitpréparée à un volume final de 110 mL, quels volumes de soluté et de solvent doiventêtreutilisés? • Cecireprésente 1 partied’échantillonajoutée à 9 parties de diluant. • En autresmots, quelest le volume de 1 partie et de 9 parties?

  26. Facteur de Dilution • EXEMPLE: Quelest le facteur de dilution sivousajoutez 0.1 mL d’un spécimen à 9.9 mL de diluant? • Le volume final estégal au volume de l’échantillon PLUS le volume du diluent: 0.1 mL + 9.9 mL = 10 mL • Le facteur de dilution estégal au volume final diviser par le volume de l’échantillon : 10 mL/0.1 mL = Facteur de dilution de 100X

  27. Exemple d’un Problème • Quel est le facteur de dilution quand 0.2 mL est ajouté à 3.8 mL de diluant?

  28. Dilutions en série • Si une dilution de 1/8 d’une solution mèreestfaitesuivie par une dilution de 1/6 quelleest la dilution finale? • La dilution finale est: 1/8 x 1/6 = 1/48

  29. Dilutions • Moyen de réduire une concentration • Dilution: Une fraction du facteur de dilution Facteur de dilution = Conc. que j’ai Conc. que je veux Ex. Vous avez une solution de 25 mg/mL et désirez une solution de 5mg/mL Facteur de dilution = 25mg/mL 5mg/mL = 5X Dilution = 1/le facteur de dilution = 1/5 = 1 partie/5 parties Totales

  30. Exemple • Comment est-ce que vous prépareriez 25 mL d’une solution de 2mM à partir d’un mère de 0.1M

  31. Quantités • Les quantité ne sont PAS égales aux concentrations! • Ex 1. • Deux pommes par sac = une concentration • Deux pommes = une quantité • Ex 2. • 10g par 100 mL = une concentration • 10g = une quantité

  32. D’une concentration aux quantités • La concentration indique la quantité dans un volume donné • Ex. 1mM = 1millimole par chaque litre • Donc la quantité dans 1 L est 1 millimole • Quel volume de la solution auriez vous besoin pour avoir 0.05 millimoles?

  33. Électrophorèse sur Gel d’Agarose • Séparation de molécules d’acides nucléiques simples ou doubles brins d’après leur taille et leur conformation • Sépare les fragments entre 100pb et 10 Kbp • Pouvoir de résolution entre fragments ≥100pb

  34. Puit Linéaire Relâché Direction de migration Super enroulé 8 Migration Sur Gel d’Agarose Haut (-) Bas (+)

  35. Que peut-on déterminer d’une électrophorèse sur gel d’agarose? • Est-ce qu’il y a de l’ADN • Combiens de conformations • Combien de fragments • Taille des fragments • Taille totale des molécules d’acides nucléiques • Nombre de coupures • Linéaire? • Circulaire?

  36. Résolution Résolution 1.0% Log de la taille 1.5% Distance de Migration Profil de Migration sur Agarose

  37. Déterminer les tailles Taille (pb) Distance (mm) 23,000 11.0 9,400 13.0 6,500 15.0 4,400 18.0 2,300 23.0 2,000 24.0

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