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转氢酶(GOT、GPT)的提取和测定 (分光光度法 )

转氢酶(GOT、GPT)的提取和测定 (分光光度法 ). 实验目的. 熟悉转氨酶的测定方法。. 实验原理. 氨基酸分子上的 氨基 转移到 α — 酮酸 分子上的反 应，称为转氨反应，由转氨酶催化。谷氨酸 — 草 酰乙酸转氨酶 (GOT) 和谷氨酸 — 丙酮酸转氨酶 (GPT) 是两种最普遍的转氨酶。. GOT 能催化如下反应： 此反应可与苹果酸脱氢酶相偶联，从而用来测定该酶的活性。 测定 NADH 在 340nm 或 366nm 处的吸光度的变化， 即可计算 GOT 的活性。. GPT 能催化如下反应：

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转氢酶(GOT、GPT)的提取和测定 (分光光度法 )

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Presentation Transcript

  1. 转氢酶(GOT、GPT)的提取和测定(分光光度法)

  2. 实验目的 • 熟悉转氨酶的测定方法。

  3. 实验原理 • 氨基酸分子上的氨基转移到α—酮酸分子上的反 • 应，称为转氨反应，由转氨酶催化。谷氨酸—草 • 酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸—丙酮酸转氨酶 • (GPT)是两种最普遍的转氨酶。

  4. GOT能催化如下反应： 此反应可与苹果酸脱氢酶相偶联，从而用来测定该酶的活性。 测定NADH在340nm或366nm处的吸光度的变化， 即可计算GOT的活性。

  5. GPT能催化如下反应： 反应与乳酸脱氢酶相偶联， 生成的丙酮酸转化为乳酸，NADH变成NAD+ 测定340nm处NADH的OD值， 即可计算GPT的活性。

  6. 器材与试剂 • 1．实验仪器 搅拌器，紫外分光光度计，冷冻离心机，试管，烧杯 • 2．实验试剂 苹果酸脱氢酶，乳酸脱氢酶， • 3mg／ml NADH，0.005mol／Lα-酮戊二酸， • 0．2mol／L D,L—天门冬氨酸盐， • 0．2mol／L D,L—丙氨酸 • (以上试剂均用0.05mol/L Tris—HCl(pH 7．2)缓冲液配制 • 3．实验材料 日本珊瑚树嫩叶

  7. 实验步骤 • 1．酶粗提液的制备 • 称取植物材料日本珊瑚树嫩叶 1g，按质量g:体积=1:9 • 的比例，加入9倍体积PH7.2的0.05mol/LTris—HCl缓冲 • 液，用搅拌器进行搅拌 • 使之混匀，得到的匀浆在0℃下用20 000g离心20min，上 • 清液即为酶的租提液。 • 2．酶活性的测定(分光光度法)

  8. 操作过程： (1)ＧＯＴ活性的测定 按表下表所示加入溶液体积数，配成COT反应液。 混匀，室温放置5 分钟，505nm 波长，双蒸水调零，测各管 OD 值。 以（绝对OD 值=测定管OD 值－对照管OD 值），查标准曲线，求得相应的AST∕GOT活力单位。

  9. (2）ＧＰＴ活性的测定 按下表所示加入溶液体积数，配成GPT反应液。 混匀，室温放置5 分钟，505nm 波长，双蒸水调零，测各管 OD 值。 以（绝对OD 值=测定管OD 值－对照管OD 值），查标准 曲线，求得相应的ALT∕GPT活力单位。

  10. 先计算得到每µmol NADH的0D值，则可计算酶的活性大 • 小。为此先读取未加酶时反应的0D值，除以反应液中 • NADH的量(3mg／ml=4.5mmol)，即0D／4500 µmol，就 • 可以得到1µmolNADH被氧化时0D的变化值。

  11. 计算公式： 本实验计算只需根据AST∕GOT和ALT∕GPT标准曲线计算公式求得对应的卡门氏单位即可。

  12. 注意事项 1、比色法中常用的有赖氏（Reitman-Frankel）法及金氏（King）法。赖氏法标准曲线所定单位数，是用实验方法和卡门氏分光光度法（速率法）作对比测定求得的。以卡门氏单位报告结果，比较准确。 卡门氏单位定义：1ml 液体，反应液总容量 3ml，340nm 波长，1cm 光径，25℃，1min 内所生成的丙酮酸，使NADH氧化成NAD+而引起吸光度每下降 0.001 为一个卡门氏单 位。 （1 卡门氏单位=0.482IU/L,25°C） 2、当标本酶活力超过 150 卡门氏单位时，应用生理盐水将标本稀释后进行测定。 3、加入 2，4-二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全，加氢氧化钠溶液方法要一致，不同方法会导致吸光度读数的差异。

  13. 附1：AST∕GOT标准曲线

  14. 附2：ALT∕GPT标准曲线

  15. The end thank you!

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