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Tecnologia do DNA recombinante

QBQ 0102 – Educação Física. Carlos Hotta. 18/06/13. Tecnologia do DNA recombinante. A Tecnologia do DNA recombinante. A tecnologia do DNA recombinante nos permite manipular sequências de DNA e introduzi-las em novos organismos.

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Tecnologia do DNA recombinante

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Presentation Transcript

  1. QBQ 0102 – Educação Física Carlos Hotta 18/06/13 Tecnologia do DNA recombinante

  2. A Tecnologia do DNA recombinante • A tecnologia do DNA recombinante nos permite manipular sequências de DNA e introduzi-las em novos organismos

  3. 1975 – Escherichia coli capaz de produzir proteína de Salmonella

  4. Polimerase Chain Reaction

  5. Gel de agarose • O DNA é negativo e é atraídopelopólopositivo do aparato; • A malha de agaroseatrapalha a migração de moléculasmaiores, queacabammigrandomaisdevagar no gel; • O DNA é visualizado com marcadoresfluorescentes e o tamanhoproduzido é estimado com a adição de marcadores com o tamanhoconhecido.

  6. Plasmídeos • Plasmídeos são DNA circulares, muito menores que um cromossomos circular, que podem complementar as sequências do genoma da bactéria • Plasmídeossãocapazes de se auto-replicar e podemapresentarmúltiplascópiasemumasócélula • Plasmídeosgeralmentepossuem: origem de replicação, um local de múltiplossítios de restrição, um gene de resistência a antibiótico

  7. Enzimas de restrição cortam o DNA • Enzimas de restrição são endonucleases com capacidade de cortar o DNA em sequências específicas • Geralmentereconhecempalíndromos no DNA • Nãonomeadas de acordo com seuorganismo de origem -> Escherichia coli

  8. Enzimas de restrição podem gerar pontas coesivas ou pontas cegas

  9. Há centenas de enzimas de restrição diferentes

  10. Ligação

  11. Transformação • Bactériaspodemincorporar um plasmídeoporchoquetérmicooueletroporação • No choquetérmicohá a incorporação de DNA após um tratamentorápido a 37oC a 42oC. • Na eletroporação, um pulso de altavoltagemfaz com que a memebrana da bactériapermita a entrada dos plasmídeos.

  12. Mas como usar genes de eucariotos em procariotos?

  13. A transcriptase reversa transforma o RNA em DNA • A transcriptase reversanospermitetornar o RNA novamenteem DNA (cDNA) • O cDNA é maisestávelque o RNA e podeserusadoemreações de PCR • Geralmente as sequênciasobtidassão de RNA maduro

  14. Animais e plantastransgênicas • Transgênicossãoorganismosquetiveramseugenomaalteradoutilizando-se a tecnologia do DNA recombinante • A agriculturaconvencionalvêmintroduzindo genes novosnosorganismosfazanos

  15. Como se geraanimaistransgênicos?

  16. A Agrobacterium tumefaciens é capaz de tarsnferirsequênciasdefinidaspara o genoma das plantas

  17. Sequenciamento de DNA usa di-deoxi nucleotídeos

  18. Sequenciamento de DNA usavam 4 reações distintas de replicação

  19. Atualmente usa-se dideoxi nucleotídeos com marcadores fluorescentes • Automatizaçãopermitesequenciar 96 sequênciasporvez, 8 a 12 vezespordia • 96 x 10 x 1000 = 960 mil pbpordia!

  20. Novas técnicas de sequenciamento permitem a obtenção de milhões de sequências simultâneas • Pode-se obter o mesmonúmero de sequênciasque no ProjetoGenomaemquestão de dias • Existemdiversastécnicasenvolvidasquegeramdiversostipos de sequências (de 50 pb a 10000pb) emdiversasquantidades (de milhares a centenas de bilhões) • Como analisar? • A busca é a do genomahumanopor U$1000 -> cadapessoa no planetapodeterseuprópriogenomasequenciado! • Porquêsequenciar?

  21. O 454 é um (velho) sequenciador de nova geração

  22. O pirosequenciamento mede a luminescência produzida quando um deoxinucleotídeo é incorporado

  23. O segredo está na capacidade de isolar, amplificar e sequenciar milhões de sequências em paralelo

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