Analiza structurala prin raze X

1. Analiza structurala prin raze X Transformata Fourier si cristalografia de raze X Cea mai mare putere a rezolutiei pentru determinarea structurilor macromoleculelor si complexelor macromoleculare

2. Matematic: transformata Fourier si inversa ei convertesc dintre doua domenii (“spatii”) r (exemplu: spatiu sau timp) si domeniul k (exemple: momente sau frecvente)

3. Transformata Fourier

4. Pierderea fazei prin transformata Fourier inversa unidirectionala Daca se considera faza corecta Faza incorecta (=0)

5. In doua dimensiuni (xy) Aranjare hexagonala a “pick”-urilor Amplitudine si faza

6. Unele componente au fost sterse Se regaseste distributia initiala Componente de amplitudini mici au continut redus de informatie

7. Aplicatie: metoda de reduce a zgomotului 1. Transformata Fourier a unui obiect zgmotos 2. Se substituie anumite componente de amplitudine mica din transformata Fourier = 0 3. Se face transformata Fourier inversa

8. Doar o sectiune prin transformata Fourier Distorsiunesemnificativadaca se folosestedoar un numarredus de coordonatepentrureconstructie

9. Exemplu de design experimental Imaginea de difractie a cristaluluiestetrasformata Fourier a structurii

10. Difractia pe un singur punct

11. Difractiapedouaobiectepunctiforme

12. Interferenta constructiva daca rS=0,+1, +2, • Interferenta destructiva daca rS=+1/2, +3/2, • Imaginea de difractie F(S) este data de:

13. Pentru un obiect macroscopic constand din maimultepuncte cu diverse puteri de imprastiere:

14. Densitatea electronica a structurii proteinei poate fi obtinuta din inversa transformatei Fourier a imaginii de difractie

15. In microscopie, inversatransformatei Fourier estefacuta de catre lentile!

16. Nu exista microscop de raze X cu rezolutie si sensibilitate suficienta • Oglinzile de raze nu au rezolutiei suficienta pentru o singura proteina. • Puterea radiatiei ar trebui sa fie prea mare iar proteina ar fi …. denaturata

17. Procedeu general: • Se inregistreaza imaginea de difractie a cristalului proteic • Se calculeaza inversa transformatei Fourier • Dezavantaj: se pierde informatia de faza

18. Problema fazelor • Metode prin care se incearca cunoasterea fazelor • Cea mai folosita metoda: inlocuirea cu atomi grei

19. Un specific al difractiei pe cristale macroscopice: nu se obtine o image continua ci spoturi de difractie

20. Reteacristalina in spatiul real/reciproc

21. Celula unitara: cea mai mica unitate din care se poate genera cristalul doar prin translatii • Pentru un cristal proteic celula unitara este formata din una sau mai multe molecule

23. Cristalografia de raze X a proteinelor http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgi-bin/pdbsum/GetPage.pl?template=highlights.html&pdbcode=n/a&highlights=TRUE

24. Producerea unor cristale adecvate Monoscrital cu geometrie si marime potrivita Transparente Fara neomogenitati Fara culoare sau indice de refractie Adecvate Neadecvate In mod obinuit, neadecvate

25. Metoda “picaturii”

26. Robot pentru metoda picaturii

27. Se incepe cu o concentratie de proteina de 2-50 mg/ml • Nu trebuie sa contina contaminanti (alte proteine, virusuri) • Fara proteine impachetate gresit • Fara aditivi chimic care nu sunt necesari la stabilitate • Proteinele cu capete mai putin flexibile cristalizeaza mai bine • Dimensiunea optima a cristalului: ~0,1 mm

28. Exista kituri comerciale petru “screening” de cristalizare http://www.jenabioscience.com/cms/en/1/browse/631_macromolecular_crystallography.html

29. Parametri importanti: • Concentratia proteinei • Tipurile de sare si concentratia lor • pH • Tipul si concentratia surfactantilor • Temperatura • Viteza de cristalizare

31. Detector CCD (charge-coupled device)

32. Sursa: anod rotitor sau sincrotron

33. Sincrotron

34. Imaginea de difractie

35. Determinareafazei, inlocuirea cu atomigrei Cristalizare in solutie care contineatomigrei

36. Calcularea densitatii elecronice si rafinarea structurilor http://www.netsci.org/Resources/Software/Struct/xray.html