第三章 培养基灭菌

1. 第三章 培养基灭菌 • 重点：消毒与灭菌的区别；灭菌方法；加热灭菌的原理；影响培养基灭菌的其他因素；培养基灭菌时间计算；分批灭菌和连续灭菌比较； • 难点：培养基灭菌时间计算；

2. 一、消毒与灭菌的区别： • 所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢。 • 消毒是指消灭一切致病微生物（病原体）。 • 二、消毒与灭菌在发酵工业中的应用 • 牛奶巴氏消毒法：80-95℃，10min • 发酵培养基的灭菌:121℃,20min

3. 三、灭菌方法： • 1、干热灭菌：灼烧灭菌；加热方式有电热、红外线加热等；相对与湿热灭菌，干热要求时间长，温度高（一般160℃，2hr） • 1）火焰焚烧法：接种环、试管口等 • 2）干烤法：利用热空气灭菌 • 用法：160℃,2小时 • 特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态下不易杀死。所以温度高、时间长。

4. 2、湿热灭菌：蒸气释放热量，使微生物蛋白质变性。2、湿热灭菌：蒸气释放热量，使微生物蛋白质变性。 • 特点：温度低、时间短、灭菌效果好 • 原因： • 1) 菌体内含水量越高，则凝固温度越低； • 2) 蒸汽冷凝会放出潜热； • 3) 饱和水蒸汽穿透力强； • 4) 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。

5. 湿热灭菌优点： 1）蒸气来源易，低价无毒； 2）蒸气穿透力强灭菌彻底； 3）蒸气冷凝释放热量； 4）蒸气易输送，易调节，易管理。 湿热灭菌缺点： 1）设备费用高； 2）不能用于怕受潮的物料；

6. 3、射线灭菌法： • 1）电离辐射：χ、γ、β射线 。 原理 ：引起水和其他物质的电离，产生游离基，破坏DNA，从而造成细胞损伤。 • 特点；穿透力强，无专一性，对所有生物均有杀伤作用。 • 适用：菌种诱变。

7. 2）非电离辐射（紫外线） • 方法：在波长265-266nm处，杀菌力最强。 • 原理： • （1）作用于DNA ，使同链DNA相邻嘧啶间形成嘧啶二聚体，引起DNA结构变形，阻碍正常的碱基配对，从而造成菌的变异或死亡。（光复活酶可修复） • （2）有氧时产生过氧化氢，强氧化杀菌。 • 适用：空气、水的消毒杀菌（紫外灯）。 • 特点：穿透力差。

8. 4.过滤灭菌法 • 采用介质过滤的方法阻截微生物达到除菌的目的 • 主要用于空气灭菌

9. 4、化学药品灭菌 • 方法：浸泡、熏蒸、喷洒、擦拭等，常用化学药品： • 1）表面消毒剂： • （1）酚类： • 石炭酸（苯酚），0.1%抑菌；1%杀菌 • 甲酚皂（甲酚+肥皂）：3-5%皮肤消毒 • 机理：作为表面活性剂，使膜损伤；蛋白质变性 • P.C.（石炭酸系数）：为消毒剂杀菌效率的标准。 • 是在一定时间内（10min）被测试的药剂能杀死全部供试微生物的最高稀释度与达到同样效果的酚最高稀释度的比值。

10. （2）醇类： • 乙醇：70-75%杀菌效率最高 • 机理：具脱水作用，能穿透菌体进入蛋白质分子肽链间隙，使蛋白质变性或脱水沉淀，造成微生物死亡。 • 无水乙醇：表面蛋白凝固，保护膜，杀菌力差 • 甲醇可使眼睛失明，故不宜做消毒剂；其他醇因不溶于水，一般不用。

11. （3）醛类： • 甲醛： 机理：蛋白质烷化剂； 应用：福尔马林（40%）；10%的甲醛熏蒸，用于空气灭菌。 • （4）表面活性剂： • 可降低表面张力效应的物质。 • 机理：使菌体细胞膜破损；使菌体蛋白质变性。 • 种类：洗必泰、新洁尔灭等 • 特点：快速、彻底、效率高

12. （5）氧化剂类： • 机理：破坏蛋白质的巯基，强氧化剂可破坏蛋白质的氨基与酚羟基 • 碘酒 7g I：5g KI，溶于100ml 95%乙醇。 • 1%碘酒10min可杀死芽孢杆菌和部分真菌， • 并使流感病毒灭活。 • 漂白粉（氯化钙与次氯酸钙的混合物）

13. （6）重金属及其化合物： • 所有重金属盐Cu、As、Ag、Hg等对微生物均有毒性。 • 机理： • 1）可与酶蛋白的-SH基结合，使酶失活； • 2）易与带阴电荷的菌体蛋白吸附，使之变性沉淀。 • 应用：波尔多液、红汞、硝酸银等。 • 特点：简便。但使用应谨慎，防止在体内积累。

14. （7） pH的杀菌作用 • 酸: 蛋白质变性 • 无机酸:杀菌力与H+浓度成正比。 • 有机酸:与不电离的部分成正比,故有时有机酸的灭菌效果>无机酸，分子杀菌力大于离子。 • 碱: 强碱造成蛋白质、核酸大分子变 性、水解，使菌死亡。

15. 2）抗代谢药物 • 机理：与正常代谢产物同时存在，并产生竞争性拮抗作用（与相应酶竞争性结合）。只有当正常代谢产物的量少或不存在时，抗代谢物才有用。 • 种类：磺胺——抑制叶酸合成 • 6 - 巯基嘌呤——抑制嘌呤合成 • 5 - 甲基色氨酸——抑制氨基酸合成 • 机理：磺胺——对氨基苯甲酸的类似物，竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，抑制叶酸合成

16. 3）抗生素 （1）抗生素：生物产生的一种次生代谢产物或其衍生物，在低浓度下抑制或影响其他生物的生命活动。 • （2）抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，将这一范围称该抗生素的抗菌谱。 • 广谱：对多种微生物有作用（四环素G+，G-） • 窄谱：仅对某一类微生物有作用（青霉素G+） • （3）效价：抑菌圈大小，生物活性单位，标准曲线

17. 抗生素作用机理： • 1）对细胞壁形成有抑制作用；（如：青霉素） • 2）影响细胞膜功能；（如：多粘菌素） • 3）抑制蛋白质合成；（如：绿霉素、链霉素） • 4）干扰核酸代谢；（如：利福霉素、灰黄霉素） • 抗药性：变异、适应、进化 • 原因：药物无效；药物被修饰； • R质粒（药物抗性基因）

18. 二、湿热灭菌的原理 • 1.微生物的热阻：微生物对热的抵抗力；定义：微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。 • 相对热阻：两种微生物的热阻之比。 • 例如：芽孢/大肠杆菌=3000000/1；（表3-1） • 病毒/大肠杆菌=1—5/1 • 致死温度：杀死微生物的极限温度； • 致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物的时间； • 温度越高，致死时间越短。

19. 2.微生物的热致死动力学：对数残留定律。 菌体是一个复杂的高分子体系，其受热被杀死，主要的原因是高温能使蛋白质变性，这种反应属于单分子反应（一级反应），因此，杂菌在一定温度下受热死亡的过程可用单分子反应历程加以描述。 -dN/dt = k * N 式中dN/dt：表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率 N：表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数 K：表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数

20. 上式的积分形式为： • t = （2.303/k） × lgN0/Nt • 式中——N0，Nt： 分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个/ml） • 灭菌时间 t 取决于污染程度N0、灭菌程度 Nt 与灭菌速度常数k • 灭菌程度：对于 Nt ，如果取Nt = 0，那么，t = ∞，这显然是与现实情况不符。 • 对于如何Nt取值？通常取Nt= 10-3，即灭菌1000次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。这个数值的取值的大小，也间接反应了该生产过程中的技术管理水平。

21. 3.热致死反应的速度常数K • K是表达微生物耐热性的特征常数，K除了决定于菌体的种类及存在形式外，还是温度的函数（与普通化学反应一样），因此灭菌温度的选择是灭菌操作的核心。 • K越小，该微生物越耐热，121℃细菌芽孢K为1min-1,而营养细胞为10-1010min-1 • 4、杀灭芽孢的温度和时间 • 不同芽孢耐热性不同,培养条件不同,耐热性也不同。

22. 5.灭菌温度的选择 • 温度对化学反应的影响特别显著，主要是影响速度常数。 • 灭菌温度的选择应考虑的因素主要有： • 1）微生物的热致死温度，应高于该温度，通常以芽孢为准。 • 2）高温对营养成分的破坏，灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程，因此，灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。

23. 速度常数与温度之间的关系（阿累尼乌斯公式）：速度常数与温度之间的关系（阿累尼乌斯公式）： K= A×e[-E/RT] • 式中—K：速度常数，1/S • E,：活化能（J/mol） • R：气体常数，1.987*4.18 J/mol*k • T：反应的绝对温度，k • 上式也可表示为： • lgK=-E/2.303RT+lgA • 对于某种特定的细菌，活化能E也是一定的，因此，灭菌速度常数的对数lgK与灭菌温度T成反比。

24. 三、影响培养基灭菌的其他因素 • 温度:致死温度，蛋白质变性 • 灭菌时间：灭菌需维持一段时间才能达到效果 • 培养基成分：保护作用； • pH值： pH值6-8，微生物最耐热，表3-4； • 培养基中的颗粒：颗粒大，灭菌难； • 泡沫：不利于灭菌。 • 水分含量：水少-温高时长 • 微生物数量的影响：数量多，灭菌时间长

25. 第二节 灭菌的计算与操作 • 分批灭菌：分批灭菌操作要点 • (1)定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。 • (2)培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气。 • (3)培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到100℃时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当培养基的温度升温到100℃时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。

26. (4)注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。(4)注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。 • 保温期间温度：118—121℃，时间：30分钟。 • (5)灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。 • 分批灭菌时间的计算：例3-1 • 连续灭菌时间计算： t = （2.303/k） × lnN0/Nt 式中N0、Nt分别为单位体积培养基灭菌前后菌数

27. 二、培养基连续灭菌计算与操作 • 连续灭菌又称为连消，即在一套专门灭菌设备中，培养基连续进料、瞬时升温、短时保温、尽快降温的过程。

28. 七、分批灭菌与连续灭菌比较 • 连续灭菌的优点： • 1、可采用高温短时，培养基破坏少； • 2、发酵罐利用率高； • 3、蒸汽负荷均衡； • 4、可节约能源； • 5、劳动强度小。

29. 培养基灭菌条件 • 1、分批灭菌：121℃，30min，适用于一般培养基、消泡剂等； • 2、连续灭菌：130 ℃，5min，也有115 ℃，6-8min • 3、其他：如尿素溶液105 ℃，5min

30. 思考题 • 1.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？灭菌过程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。