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第六章 细胞内膜系统 与蛋白质分选

第六章 细胞内膜系统 与蛋白质分选. INTRACELLULAR COMPARTMENT AND PROTEINS SORTING. 本章内容提要. 第一节 蛋白质分选的基本原理 一、蛋白质分选信号 二、蛋白质分选运输的途径 第二节 膜泡运输 一、衣被类型 二、衣被的形成 三、膜泡运输的定向机制 四、细胞的内吞与外排. 第三节 内质网 一、形态与组成 二、 RER 的功能 三、 ER 的其它功能 第四节 高尔基体 一、形态与组成 二、功能区隔 三、主要功能 第五节 溶酶体与过氧化物酶体.

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第六章 细胞内膜系统 与蛋白质分选

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  1. 第六章细胞内膜系统与蛋白质分选 INTRACELLULAR COMPARTMENT AND PROTEINS SORTING

  2. 本章内容提要 第一节 蛋白质分选的基本原理 一、蛋白质分选信号 二、蛋白质分选运输的途径 第二节 膜泡运输 一、衣被类型 二、衣被的形成 三、膜泡运输的定向机制 四、细胞的内吞与外排 第三节 内质网 一、形态与组成 二、RER的功能 三、ER的其它功能 第四节 高尔基体 一、形态与组成 二、功能区隔 三、主要功能 第五节 溶酶体与过氧化物酶体

  3. 定义：结构、功能和发生上相关的内膜形成的细胞结构称为细胞内膜系统，如核被膜、内质网、高尔基体等。定义：结构、功能和发生上相关的内膜形成的细胞结构称为细胞内膜系统，如核被膜、内质网、高尔基体等。 • 功能：区隔化；增加内表面积，提高代谢和调节能力。 • 从系统发生来看内膜系统起源于质膜的内陷和内共生。 • 从个体发生来看新细胞的内膜系统来源于原有内膜系统的分裂，具有核外遗传的特性。

  4. 第一节 蛋白质分选的基本原理 • 膜结合核糖体合成的蛋白质进入内质网后的运输是通过小泡转运实现的,其机理涉及三个基本问题: • ①小泡是怎样形成的? • ②不同类型小泡如何准确到达作用部位? • ③小泡与细胞质膜、小泡与小泡之间是怎样融合的?

  5. 细胞内合成的蛋白质、脂类等物质之所以能够定向的转运到特定的细胞器取决于两个方面：细胞内合成的蛋白质、脂类等物质之所以能够定向的转运到特定的细胞器取决于两个方面： • 其一是蛋白质中包含特殊的信号序列（signal sequence）。 • 其二是细胞器上具特定的信号识别装置（分选受体，sorting receptor）。

  6. 一、蛋白质分选信号 • ①信号序列（signal sequence）：存在于蛋白质一级结构上的线性序列，通常15-60个氨基酸残基，有些在完成蛋白质的定向转移后被信号肽酶（signal peptidase）切除；通常信号序列对所引导的蛋白质没有特异性要求，每一种信号序列决定特殊的蛋白质转运方向。 • ②信号斑（signal patch）：存在于完成折叠的蛋白质中，构成信号斑的信号序列之间可以不相邻，折叠在一起构成蛋白质分选的信号。

  7. signal sequence and signal patch

  8. 二、蛋白质分选运输机制 • 1、门控运输（gated transport）：如通过核孔复合体的运输。 • 2、跨膜运输（transmembrane transport）：蛋白质通过跨膜通道进入目的地。如细胞质中合成的蛋白质通过线粒体上的转位因子（translocator）进入线粒体。 • 3、膜泡运输（vesicular transport）：被运输的物质在内质网或高尔基体中加工成衣被小泡，选择性地运输到靶细胞器。

  9. 第二节 胞内膜泡运输 • 细胞内膜系统之间的物质传递常常通过膜泡运输方式进行。各类运输泡之所能够被准确地运到靶细胞器，主要取决于膜的表面识别特征。 • 大多数运输小泡是在膜的特定区域以出芽的方式产生的。其表面具有一个笼子状的由蛋白质构成的衣被（coat）。这种衣被在运输小泡与靶细胞器的膜融合之前解体。

  10. 衣被小泡在细胞内沿微管运输。 • 与膜泡运输有关的马达蛋白有3类，在这些马达蛋白的牵引下，可将膜泡运到特定的区域。 • 动力蛋白（dynein），趋向微管负端； • 驱动蛋白（kinesin），趋向微管正端； • 肌球蛋白（myosin），趋向微丝的正极。

  11. 一、衣被类型 • 已知三类： • 笼形蛋白（clathrin）或网格蛋白 • COPI • COPII • 主要作用： • 选择性的将特定蛋白聚集在一起，形成运输小泡； • 如同模具一样决定运输小泡的外部特征。

  12. 三种衣被小泡的功能

  13. 分泌蛋白与膜蛋白经小泡运输的分选信号 三种不同类型运输小泡的形成和定向运输都是由信号指导的。如KDEL信号是内质网蛋白的滞留信号, 因此KDEL是COPⅠ型小泡形成的信号。小泡形成不仅需要信号,同时也需要衔接蛋白和信号受体

  14. （一）笼形蛋白衣被小泡 • 在大量进行内吞活动的细胞(如肝细胞、成纤维细胞)中,细胞质膜有许多网格蛋白小窝。这些小窝的形成需要很多衔接子(adapter)和网格蛋白,小泡最后与质膜的脱离还需要一种称作发动蛋白(dynamin)的GTP结合蛋白 成纤维细胞质面的网格蛋白被膜小窝的电子显微镜照片

  15. P401王 （一）笼形蛋白衣被小泡（披网格蛋白小泡） • 相关运输途径：质膜→内体，高尔基体→内体，高尔基体→溶酶体、植物液泡。 • 结构：典型的披网格蛋白小泡的直径为50～100nm。网格蛋白由相对分子质量为180kDa的重链和相对分子质量为35～40kDa的轻链组成二聚体, 三个二聚体形成包被的基本结构单位--三联体骨架(triskelion), 称为三腿蛋白(three-legged protein)。许多三腿复合物再组装成六边形或五边形网格结构,即包被亚基,然后由这些网格蛋白亚基组装成披网格蛋白小泡 。 (a) 网格蛋白的三腿复合物;(b)网格蛋白包被亚基;(c)披网格蛋白小泡。

  16. 笼形蛋白的结构，A电镜照片，B分子模型，C衣被模型笼形蛋白的结构，A电镜照片，B分子模型，C衣被模型

  17. 衔接蛋白与膜受体细胞质结构域中的信号序列相互作用衔接蛋白与膜受体细胞质结构域中的信号序列相互作用 • 衔接蛋白(adaptin)：介于笼形蛋白与配体受体复合物之间，起连接作用。 • 目前已知有三种衔接蛋白:AP1、AP2和AP3。 • AP1: 衔接蛋白AP1参与反面高尔基体的披网格蛋白小泡的出芽。由于M6P受体蛋白既存在于反面高尔基体又存在于细胞质膜,所以这种受体既能同AP1作用又能与AP2相互作用。 • AP2: 衔接蛋白AP2是由α衔接蛋白(α链)和β衔接蛋白(β链)两种衔接蛋白组成的异二聚体。参与反面高尔基体网络的披网格蛋白小泡的组装。 • AP3: 最近在酵母和鼠的研究中又鉴定了一种衔接蛋白, AP3，具有AP3突变的酵母,反面高尔基体的某些蛋白就不能被运输到液泡、溶酶体。

  18. Clathrin coated vesicles

  19. 披网格蛋白小泡的形成和运输 ①被膜小窝的形成 ②披网格蛋白小泡的形成 ③无被小泡的形成 ①网格蛋白被膜小窝是披网格蛋白小泡形成过程中的一个中间体。在胞吞过程中, 吞入物(配体)先同膜表面特异受体结合, 然后网格蛋白装配的亚基结合上去, 使膜凹陷成小窝状。由于这种小窝膜外侧结合有许多网格蛋白, 故称为网格蛋白被膜小窝。 ②在形成了网格蛋白被膜小窝之后, 很快通过出芽的方式形成小泡，即披网格蛋白小泡, 小泡须在发动蛋白的作用下与质膜割离。由于此时的小泡外面有网格蛋白包被, 故称为被膜小泡。 ③披网格蛋白小泡形成之后, 很快脱去网格蛋白的外被, 成为无被小泡。在真核细胞中有一种分子伴侣Hsp70催化披网格蛋白小泡的外被去聚合形成三腿复合物, 并重新用于披网格蛋白小泡的装配 Ca2+ 参与了披网格蛋白小泡包被的形成和去被的过程。在形成包被时, 钙泵将Ca2+ 泵出细胞外, 使胞质中的Ca2+ 保持低浓度, 有利于有被小窝的形成。一旦形成被膜小泡, Ca2+ 同网格蛋白的轻链结合, 使包被不稳定而脱去。

  20. 当笼形蛋白衣被小泡形成时，可溶性蛋白dynamin聚集成一圈围绕在芽的颈部，将小泡柄部的膜尽可能地拉近（小于1.5nm），从而导致膜融合，掐断（pinch off）衣被小泡。发动蛋白是一种胞质溶胶蛋白,有900个氨基酸, 能够同GTP结合并将GTP水解。发动蛋白的作用是在被膜小窝的颈部聚合,通过水解GTP调节自己收缩, 最后将小泡与质膜割开。

  21. （二）COP I衣被小泡 ( COP I被膜小泡 ) • 结构：COPⅠ是一种胞质溶胶蛋白质复合物,由7个亚基组成:α、β、β‘、γ、δ、ε、ζ。COPⅠ在出芽小泡的胞质溶胶面聚合, 形成COPⅠ被膜小泡。由COPⅠ作为外被的小泡称为COP Ⅰ被膜小泡。 • 功能：负责回收、转运内质网逃逸蛋白escaped proteins）返回内质网。 Cop I Vesicles

  22. Cop I and II Vesicles COP I还可以介导高尔基体不同区域间的蛋白质运输。

  23. Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL） 回收信号：Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）。 内质网的膜蛋白（如SRP受体）在C端有一个不同的回收信号Lys-Lys-X-X。 COPⅠ被膜小泡介导的运输方向

  24. ① 一种胞质溶胶中的小分子GTP结合蛋白,即ARF,释放所结合的GDP,然后同GTP结合,形成ARF-GTP复合物,并整合在高尔基体膜中。GDP与GTP的交换是由高尔基体膜中的一种酶催化的 装配反应因子ARF被认为是外被体外被的装配和去装配的信号。是一种单体GTPase。 当ARF同GDP结合时，游离存在于胞质溶胶中,若同GTP结合，GTP使ARF的构型发生改变，暴露出它的脂肪酸链，并随即插入到供体膜中。同膜结合后的ARF——GTP可以同外被体结合，形成被膜小泡。 COPⅠ被膜小泡形成的过程 ② COPⅠ同ARF以及高尔基体膜蛋白的细胞质部分结合 ③在脂酰CoA(fatty-acyl CoA)的帮助下形成COPⅠ被膜小泡,但脂酰CoA的确切作用尚不清楚。一旦COPⅠ小泡形成就立即从供体膜释放出来，COPⅠ包被去聚合, 并与膜脱离, 这一过程是由与ARF结合的GTP水解所触发。

  25. （三）COPⅡ衣被小泡 • 介导从内质网到高尔基体的物质运输。 • 由多种蛋白质构成，Sar1GTP酶与Sec23/Sec24复合体结合在一起，Sec13/Sec31复合体覆盖在外层。 • 衣被小泡形成的部位，称为内质网出口（exit sites），该处没有核糖体。 • 大多数跨膜蛋白是直接结合在COP II衣被上，少数跨膜蛋白和多数可溶性蛋白通过受体与COP II衣被结合。 • 分选信号位于跨膜蛋白胞质面的结构域，形式多样，有些包含双酸性基序[DE]X[DE] ，如Asp-X-Glu序列 。这种信号序列与COPⅡ的一个或多个亚基结合。

  26. 二、衣被形成 • 衣被是在一类叫作衣被召集GTP酶（coat-recruitment GTPase）作用下形成的，为单体GTP酶（monomeric GTPase），即G蛋白。调节因子有： • 鸟苷酸交换因子（guanine-nucleotide exchange factor, GEF）：它催化GDP同GTP的交换 • GTP酶激活蛋白（GTPase activating protein, GAP）：它触发结合的GTP水解。 • 衣被召集GTP酶包括ARF蛋白和SAR 1蛋白。 • ARF参与高尔基体上笼形蛋白衣被与COP I衣被的形成。 • SAR 1参与内质网上COP II衣被的形成。

  27. 衣被召集GTP酶存在于细胞质中，但处于结合GDP的失活状态。衣被召集GTP酶存在于细胞质中，但处于结合GDP的失活状态。 • 内质网上形成COPII衣被小泡时，SAR1释放GDP，结合GTP而激活。 • 激活的SAR 1暴露出一条脂肪酸的尾巴，插入内质网膜，促进衣被蛋白的核化和组装，形成运输小泡。 • 活化的SAR1还可以激活磷脂酶D（phospholipase D），将一些磷脂水解，使形成衣被的蛋白牢固地结合在膜上。 • 当衣被小泡从膜上释放后，衣被很快就解体。

  28. Coat assembly COPⅡ小泡的装配需要一种称为Sar1的G蛋白的参与。当Sar1中GDP与GTP进行了交换, 诱导Sec23和Sec24蛋白的结合,接着是Sec13和Sec31蛋白的结合,最后由一种结合在ER表面的大蛋白质,Sec16与Sec23/Sec24复合物、Sec13/Sec31复合物相互作用,装配成一个完整的小泡。 COPⅡ被膜小泡的装配

  29. 课堂要点小结 • 名词：溶酶体 初级溶酶体 次级溶酶体 信号斑 笼形蛋白 • 溶酶体的类型； • 溶酶体发生的机制；（难点） • 蛋白质分选运输的途径；（简答） • 衣被的类型及其形成的机制；

  30. 三、膜泡运输的定向机制 • 无论是选择性还是非选择性的运输小泡, 它们都必须高度选择性地有方向地到达目的地。 • 那么定向运输和停泊的标志是什么呢? • 到达目的地后如何停泊? • 各种小泡都是膜封闭的结构，它们又是怎样突破膜结构的障碍释放出内含物?

  31. 三、膜泡运输的定向机制 • （一）运输小泡寻靶: SNARE 假说 （soluble NSF attachment protein receptor） • James Rothman和他的同事发现动物细胞融合需要一种可溶性的细胞质蛋白,叫做N-乙基马来酰亚胺敏感的融合蛋白(N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein,NSF)以及其它几种可溶性的NSF附着蛋白(soluble NSF attachment protein,SNAPs)。NSF是一种四聚体，四个亚基都相同。SNAPs 有α-、β-和γ- SNAPs等。 • SNARE 假说：由于NSF/ SNAPs能够介导不同类型小泡的融合,说明它没有特异性。据此Rothman提出一种假说:膜融合的特异性是由另外的膜蛋白提供的，把这种蛋白称为SNAP受体蛋白(SNAP receptors)，或称为SNAREs，这种蛋白可以作为膜融合时SNAPs的附着点。 • 作用：是介导运输小泡与靶膜的融合。

  32. 动物细胞中已发现20多种SNAREs，位于运输小泡上的叫作v-SNAREs，位于靶膜上的叫作t-SNAREs。动物细胞中已发现20多种SNAREs，位于运输小泡上的叫作v-SNAREs，位于靶膜上的叫作t-SNAREs。 SNAREs • v-和t-SNAREs都具有一个螺旋结构域，能相互缠绕形成跨SNAREs复合体（trans-SNAREs complexes），将运输小泡的膜与靶膜拉在一起，实现运输小泡特异性停泊和融合。

  33. 按照Rothman的SNARE假说，每一种运输小泡都有一个特殊的V-SNARE标志，能够同适当的靶膜上的T-SNARE标志相互作用。一种运输小泡在没有找到合适的靶位点之前有可能同几种不同的膜位点进行过暂时性地接触，这种接触是不稳定的，只有找到真正的靶位点才会形成稳定的结构 • 不同的小泡上具有不同的V-SNARE, 它能识别不同靶膜上的T-SNARE并与之结合,以此保证运输小泡到达正确的目的地。 SNAREs in vesicle transport

  34. NSF催化 SNAREs的分离，它能利用ATP作为能量通过插入几个适配蛋白（adaptor protein）将SNAREs复合体的螺旋缠绕分开，以便开始下一轮的转运。

  35. 在神经细胞中SNAREs负责突触小泡的停泊和融合。在神经细胞中SNAREs负责突触小泡的停泊和融合。 • 破伤风毒素和肉毒素等细菌分泌的神经性毒素实际上是一类特殊的蛋白酶，能够选择性地降解SNAREs，从而阻断神经传导。 • 病毒融合蛋白的工作原理与SNAREs相似，介导病毒与宿主质膜的融合。

  36. HIV fusion protein

  37. （二）Rabs在小泡运输与融合中的调节作用 • Rab蛋白家族是真核细胞中控制小泡转运的GTP结合蛋白。 • Rabs也叫targeting GTPase，属于单体GTP酶，已知30余种，不同膜上具有不同的Rabs。 • Rabs作用是促进和调节运输小泡的停泊和融合。 • Rabs与衣被召集GTP酶相似，起分子开关作用，结合GDP失活，位于细胞质中，结合GTP激活，位于细胞膜、内膜和运输小泡膜上，调节SNAREs复合体的形成。Rabs还有许多效应因子（effector）。 Rab蛋白的结构

  38. Rabs in docking

  39. Rab蛋白在小泡的转运和融合中的调节机理可能是：供体膜上的鸟嘌呤核苷释放蛋白(GNRP)识别胞质溶胶中特异的Rab蛋白，诱导GDP的释放并和GTP结合，进而改变Rab蛋白的构象，改变了构象的Rab蛋白暴露出其脂基团，从而将Rab蛋白锚定到膜上。运输小泡形成后，在V-SNARE的引导下，到达受体膜的T-SNARE部位，Rab帮助小泡与受体膜结合。Rab蛋白上的GTP水解后从膜中释放出来，而小泡却锁定在受体膜上，释放出的Rab进入胞质溶胶进行再利用Rab蛋白在小泡的转运和融合中的调节机理可能是：供体膜上的鸟嘌呤核苷释放蛋白(GNRP)识别胞质溶胶中特异的Rab蛋白，诱导GDP的释放并和GTP结合，进而改变Rab蛋白的构象，改变了构象的Rab蛋白暴露出其脂基团，从而将Rab蛋白锚定到膜上。运输小泡形成后，在V-SNARE的引导下，到达受体膜的T-SNARE部位，Rab帮助小泡与受体膜结合。Rab蛋白上的GTP水解后从膜中释放出来，而小泡却锁定在受体膜上，释放出的Rab进入胞质溶胶进行再利用 Rab蛋白在小泡运输和融合中的调节作用

  40. 四、受体介导的内吞 • 内吞可分为两类，批量内吞（Bulk-phase endocytosis）和受体介导的内吞(Receptor mediated endocytosis, RME)，批量内吞是非特异性的摄入细胞外物质，细胞表面的内陷（caveolae）是发生非特异性内吞的部位。 • 受体介导的内吞作用是一种选择浓缩机制。低密脂蛋白、运铁蛋白、生长因子、胰岛素等蛋白类激素、糖蛋白等，都是通过受体介导的内吞作用进行的。

  41. 衣被小窝（coated pits）是质膜向内凹陷的部位，相当一个分子过滤器（molecular filter）。约占肝细胞表面积的2%。受体、笼形蛋白和衔接蛋白大量集中于此处。 • 受体胞质端有一个由4个氨基酸残基组成的序列（Tyr-X-X-Φ），X为任何一种氨基酸，Φ为分子较大的疏水氨基酸，如Phe、Leu、Met等，衔接蛋白对此序列有识别能力。 • 受体同配体结合后启动内化作用，笼形蛋白开始组装。在dynamin的作用下掐断后形成衣被小泡。

  42. Clathrin coated pit on the cytosolic face of a cell

  43. 受体介导的内吞作用 大致分为四个基本过程∶①配体与膜受体结合形成一个小窝(pit); ② 小窝逐渐向内凹陷，然后同质膜脱离形成一个被膜小泡;③ 被膜小泡的外被很快解聚, 形成无被小泡, 即初级内体;④ 初级内体与溶酶体融合,吞噬的物质被溶酶体的酶水解

  44. 受体介导的内吞作用所涉及的途径 在受体介导的内吞作用中,随内吞泡进入细胞内的物质可分为三大类∶配体(猎物)、受体和膜组分, 它们有着不同的去向: 在受体介导的内吞中,配体基本被降解, 少数可被利用。大多数受体能够再利用, 少数受体被降解。通常受体有四种可能的去向: ① 受体内吞之后,大多数受体可形成载体小泡重新运回到原来的质膜上再利用，这些受体主要是通过次级内体的分拣作用重新回到细胞质膜上(如M6P受体、LDL受体)。 ②受体和配体一起由载体小泡运回到原来的质膜上再利用,如转铁蛋白及转铁蛋白受体就是通过这种方式再循环。 ③受体和配体一起进入溶酶体被降解, 如在某些信号传导中,信号分子与受体一起被溶酶体降解。 ④受体和配体一起通过载体小泡被转运到相对的细胞质膜面, 这就是转胞吞作用。 被内吞进来的膜成分有三种可能的去向: 第一种是随着细胞质膜受体分选产生的小泡一起重新回到质膜上再循环利用；第二种可能是同高尔基体融合，成为高尔基体膜的一个部分，这些膜有可能通过小泡的回流同内质网融合；第三种可能是随着溶酶残体的消失而消失。  

  45. 低密脂蛋白的吸收 LDL Particle 胆固醇主要在肝细胞中合成，随后与磷脂和蛋白质形成低密脂蛋白（LDL），释放到血液中。

  46. LDL是一种球形颗粒的脂蛋白，直径为22nm, 核心是1500个胆固醇酯；外面由800个磷脂和500个未酯化的胆固醇分子包裹,由于外被脂分子的亲水头露在外部，使LDL能够溶于血液中；最外面有一个相对分子质量为55 kDa的蛋白，叫辅基蛋白B——100(apolipoprotein B-100), 它能够与特定细胞的表面受体结合。 (a)由磷脂和未酯化的胆固醇单层构成LDL的外膜结构, 在外膜上结合一个亲水的apo-B蛋白,该蛋白可以介导LDL与细胞表面的受体结合。(b)四种类型脂蛋白的电镜照片

  47. LDL endocytosis • 当细胞进行膜合成需要胆固醇时，细胞即合成LDL跨膜受体蛋白，并将其嵌插到质膜中。LDL受体缺陷是造成血液中LDL水平升高的主要原因。 受体介导的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)内吞作用

  48. Recycling of LDL receptors

  49. (1) LDL在质膜的被膜小窝中与受体结合;(2)小窝向内出芽; (3)形成被膜小泡;(4)网格蛋白去聚合形成无被小泡(初级内体);(5)内体调整pH至酸性,使LDL与受体脱离(次级内体); (6) 受体被分拣出来,被载体小泡运回到质膜; (7)通过膜融合,受体回到质膜再利用;(8)LDL被分选进入没有受体的小泡, 与初级溶酶体融合形成次级溶酶体 (10)在次级溶酶体中,蛋白质被降解成氨基酸,胆固醇脂被水解产生胆固醇和脂肪酸。 受体介导的LDL内吞过程

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