YAC vektorid

1. YAC vektorid Vektori DNA sisaldab: CEN-tsentromeeri järjestus, TEL-telomeeri järjestused, ARS1-autonoomselt replitseeruv järjestus, AmpR geen, bakteriaalne ori paljundamiseks E. coli-s. Vektorit kasutatakse spetsiaalse pärmi rakuliiniga AB1380, mis on punase värvusega, sest seal on ooker mutatsioon ade-2 geenis, mis osaleb adeniini metabolismis, mille tulemusel koguneb punane pigment. Vektoris on SUP-4 geen, suppressor tRNA geen, mis surub maha ade-2 ooker mutatsiooni efekti ja taastab algtüübi, mille tulemusel on kolooniad värvitud. Peremeesrakkudes on ka retsessiivsed trp1 ja ura3 alleelid, mida komplementeeritakse vastavate vektori TRP1 ja URA3 alleelide poolt, mis annavad selektsioonisüsteemi YAC vektorit sisaldavate rakkude identifitseerimiseks. Võõr-DNA fragmendi kloonimine SUP4 geeni põhjustab suppressor geeni funktsiooni insertsioonilise inaktivatsiooni andes mutantse fenotüübi.

2. Tavaline elektroforees • B) Elektroforees pulsseerivas elektriväljas • Suured DNA fragmendid peavad muutma oma konformatsiooni vastavalt muutuvale elektriväljale. Vastavalt sellele peab DNA ahel ümber orienteeruma. Ümber orienteerumise aeg ja uues suunas liikumiseks parima konformatsiooni saavutamine sõltub molekuli suurusest ning seetõttu on võimalik elektroforeesil lahutada ka väga suuri DNA fragmente.

3. Faagi P1 vektorsüsteem P1 plasmiidvektor Ad10 sisaldab mitmeid P1 genoomi elemente: pac P1 pakkimisjärjestus, kaks loxP saiti, mida tunneb ära faagi rekombinaas. Kloonimisel avatakse vektor nii, et tekib kaks õlga (lühike ja pikk) mille külge ligeeritakse 85-100kb suurune võõr-DNA fragment. Rekombinantse DNA pakkimine toimub in vitrokasutades P1 pakkimisekstrakti: pakaas lõikab rekombinantset DNA-d pac saidist ja siis koostöös teiste komponentidega sisestatakse DNA faagi peasse. Lisatakse faagi saba valgud ja lastakse rekombinantsel faagil adsorbeeruda E.coli cre+ tüvele. Peremeesraku cre rekombinaas tsirkulariseerib DNA loxP saitide kohalt, ning saadud plasmiidi säilitatakse rakus madala koopia arvuga (plasmiidi replikoni poolt) kuid on võimalik ka amplifitseerida indutseerides P1 lüütilise replikoni.

4. pBAC108L Vektori komponendid: oriS ja repE: säilitavad F-faktori ühesuunalise replikatsiooni, parA ja parB: tagavad väikese koopiate arvu rakus, selektiivsed markerid: CMR-geen: resistentsusklooramfenikooli suhtes, lacZ (X-gal sööde+IPTG) Kloonimissegment: T7/SP6 promootorid; kloonimissaidid HindIII, BamHI; harva-lõikavate ensüümide restriktsioonisaidid.

5. Füüsilise ja geneetilise kaardi suhe 19. kromosoomi puhul Haldane reegel:heterogameetsel sool on madalam ristumiste (chiasma) arv.Inimesel:mehe genoom 2851 cMehk 1cM ~ 1.05Mbnaise genoom 4296 cMehk 1cM ~0.7Mb 180 markerit inimese 19. kromosoomist kaardistati füüsiliselt ja geneetiliselt. Selle 65 Mb kromosoomi füüsilist kaarti võrreldi arvuti abil saadud meiootiliste geneetiliste kaartidega meestel ja naistel. Siit on näha rekombinantide ebaühtlane jaotus piki kromosoomi; rohkem rekombinatsioone telomeeride suunas ja erinev rekombinatsioonide suhe meestel:naistel.

6. Erinevate liikide rakkude liitmisel on võimalik saada stabiilseid somaatiliste rakkude hübriide Inimese ja hiire või hamstri somaatiliste rakkude hübriidi valmistamine

7. Joonisel on näidatud PCR-il põhinev inimese mikrofibrillaarse valgu MFAP3 subkromo-somaalse lokalisatsiooni kaardistamine 5q translokatsioon ja deletsioon hübriidrakkude paneeli abil. Vertikaaljooned paremal näitavad hübriidides säilinud inimese 5 kromosoomi järjestuste ulatust.

8. Radiatsioonihübriidide kaardid A) Kromosoomide katkemine radiatsiooni tagajärjel toimub juhuslikult. Joonisel on näidatud 5 võimalust. Lähemal asuvad markerid jäävad kokku suurema tõenäosusega kui kaugemal asuvad. B) Markerite järjestamine inimese 21q peal. Numbrid näitavad vahemaad markerite vahel centiRay8000-des. Näiteks S16-S48 intervall on 8 cR8000: mis tähendab et radiatsiooni doosi 8000 rad’i korral lahutatakse nad 8% juhtudest ja jäävad kokku ühe fragmendina 92% juhtudest C) Tõenäosus, et realiseerub selline markerite järjekord võrrelduna ümberpööratud asetusega. Näiteks: on arvutatud tõenäosus markerite asukoha S16-S48-S46-S4 106 korda suurem kui paigutuse S16-S46-S48-S4 puhul

9. Genebridge-4 radiatsioonihübriidide paneeli kasutamine füüsilisel kaardistamisel Paneel koosneb 93 hamstri rakkude hübriidist, millest igaüks sisaldab keskmiselt 32% inimese genoomist paljude väikeste fragmentide kujul (keskmiselt 25 Mb). Keskandmebaasis säilitatakse teavet sadade teada oleva kromosomaalse asukohaga markerite esinemise või puudumise osas igas hübriidis. Kui kaardistada uut STS-i, siis amplifitseeritakse seda igast 93-st hübriidist ja võrreldakse saadud mustrit keskandmebaasiga.

10. Kromosoomide fraktsioneerimine läbivoolu tsütomeetria abil