第十四章 蛋白质与氨基酸分析

1. 第十四章 蛋白质与氨基酸分析 Yangchg@njau.edu.cn

2. 第一节 概 述

3. 第一节 概 述 蛋白质测定的方法分类 • 利用蛋白质中含氮进行测定：开氏定氮 • 基本概念： 1、蛋白质与粗蛋白质 2、蛋白质系数 • 利用蛋白质的理化性质测定 • 染色反应 • 双缩脲反应 • 萤光反应 • 红外光谱

4. 氮-蛋白质换算系数

5. 第二节 蛋白质的测定 一、常量法 • 新鲜鱼、肉、蛋及含硝态氮较多的蔬菜等样品粗蛋白质的测定（硫酸-催化剂消煮法） • 植物、动物饲料中粗蛋白质的测定 • 硫酸-催化剂消煮——半微量开氏法 • 硫酸-双氧水消煮法——纳氏比色法 （蒸馏法、比色法，扩散法，电极法测定） 方法原理 操作过程 方法要点 问题：1、纯蛋白质如何测定？ 2、为什么含硝态氮较多的样品必须用硫酸-催化剂消煮？

6. 二、同类种籽中粗蛋白质测定 （一）染料结合法（DBC法） • 方法原理 • 蛋白质含有一定组成的碱性氨基酸（赖氨酸、精氮酸和组氮酸），其中的ε –NH2、咪唑基、胍基和蛋白质的末端自由基在pH2~3缓冲体系中呈阳离子状态，可与偶氮染料（桔黄G、酸性橙12）等结合而沉淀，通过测定染料颜色的降低求出蛋白质的含量。比色波长为482nm. 桔红G

7. 问题 • 为什么只能直接测定同类种籽中蛋白质的相对量？ • 为什么染料溶液的pH、样品的粒度、振荡反应的时间与温度影响测定结果？ • 为什么称样量应视蛋白质含量而定？ • 普通分光光度计要稀释50倍比色。

8. 染料结合法测定蛋白质含量的影响因素 1、染料浓度对染料结合量的影响 从图2中可看出，染料浓度越大，染料的结合量越大。 为了减少工作量和降低稀释误差，应采用适宜的染料浓度，以0.04%的染煽动浓度为宜。

9. 2、样品粒度对染料结合量的影响 从图3中可看出，样品粒度越细，蛋白质的碱性基团暴露越多，染料的结合量越大。 测定时，所用样品的粒度应基本一致。

10. 3、酸度对染料结合量的影响 从图4中可看出，缓冲液的酸度影响到蛋白质中氨基酸残基所带电荷数。pH越高，其所带的电荷越少减少，染料的结合量越小，吸收A值越大。

11. 4、振荡时间与温度对染料结合量的影响 时间和温度对染料结合量均有影响。温度既可提高反应速度， 又可提高反应程度，但提高的程度不大，在±5 ℃对实验结果影响不大。 在室温下反应2h即可。

12. （二）双缩脲法 • 方法原理 • 蛋白质含的肽键含有类似天双缩脲基团（R-CH-CO-NH-CH-CO-R),能起双缩脲反应。 • 即在碱性条件下与铜离子生成紫红色可溶性络合物。蛋白质含肽键多时呈紫色，反之为红色。蛋白质含量在1~15mg时，其呈色反应符合比耳定律。比色波长为550nm.

13. 方法要点 • 样品的颜色对测定有影响 • 温度和显色时间要求严格，否则重现性不高。（室温120~190min内比色， 40℃时15~70min比色） • 须用6000rpm离心10min以上，才可能澄清比色液。 • 其它同染料结合法。

14. （三）荧光法 • 方法原理 • 荧光染料亮磺化黄素与碱性氨基酸络合，生成的络合物在430nm激发光下产生波长为510nm的荧光。荧光强度与碱性氨基酸、蛋白质含量成正比。

15. 操作过程： 120目样品50mg→离心管→5mL磷酸二氢钠-柠檬酸（pH2.2)5mL →2000rpm离心5min,弃上清液→5mL染料，室温振荡1h → 2000rpm离心5min,弃上清液（水洗1~2次）→沉淀悬浮于5mL水中进行荧光测定。 • 方法要点。 • 只能测出同类种籽中蛋白质含量的相对量。 • 注意荧光猝灭。 • 其它同染料结合法。

16. 三、植物组织中可溶性蛋白质的测定 （一）斐林—酚法（folin-酚法或Lowry法） • 方法原理 Folin-酚试剂法包括两步反应： • 第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物； • 第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正比。 • 比色波长为550nm.以小牛血清蛋白质作0~250ppm标准曲线。

17. 此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范围为5～100μg 蛋白质。 • Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用。 • 不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。

18. 操作过程 • 5g鲜样+5mL水研磨g→10000rpm离心10min →上清液1mL至试管→ 5mL斐林试剂→ 30℃下10min → 0.5mL磷钼酸/磷钨酸→ 显色10min,650nm比色。

19. （二）考马斯亮蓝法 方法原理 考马斯亮蓝（Comassie brilliant blue)Ｇ250是一种阴离子染料，在酸性介质中呈橙色，与蛋白质分子内带阳电荷的赖氨酸、精氨酸及组氨酸残基结合后变为蓝色，最大吸光在465nm，与蛋白质浓度成正比。 此显色反应快，约２min即可反应完全。生成的复合物约在１h内稳定，然后发生聚合并沉淀出来。 通过与标准血清蛋白质试样比较可求出样品蛋白质的含量。

20. 本法灵敏度为Lowry 法的4-5 倍，测定范围10-100μｇ蛋白质，微量法为1-10μｇ蛋白质。 此反应重复性好，线性关系好，精确度高。标准曲线在蛋白质浓度较大时可稍有弯曲，但不影响测定。蛋白质与染料结合量不相同，测定与标准蛋白质组成有较大差异的样品时，有一定误差。 本法干扰性物质少，少数物质如强碱性缓冲剂、蔗糖、甘油及乙酸等有一些颜色干扰，可用适当对照液消除掉。另如１%十二烷基硫酸钠（SDS）等则干扰严重，应避免参入。由于酚类及氨基酸不干扰，使其在测定生物体液或医药品中微量蛋白质时有独特的优点。 1976 年提出，现有取代Lowry 法的趋势。

21. （三）紫外吸收法测定蛋白质含量 • 方法原理 由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm 波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm 与其浓度呈正比关系，可作定量测定。 通过与标准小牛血清蛋白质相比求蛋白质含量。

22. 1．在测定工作中，可以利用280nm 及260 nm 的光密度值求出蛋白质的浓度： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45OD280nm―0.74OD260nm 式中：OD280nm是蛋白质溶液在280nm 下测得 的光密度； OD260nm是蛋白质溶液在260nm下测得 的光密度。

23. 2．对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测的蛋白质溶液稀释至光密度在0.2~2.0之间，选用光程为1cm 的石英比色杯，在280nm 及260nm 处分别测出光密度OD280nm/OD260nm 的比值，从表2 中查出校正因子“F”值，同时可查出该样品内混杂的核酸的百分含量，将F 值代入下述公式，即可计算出该溶液的蛋白质浓度。 蛋白质浓度（mg/mL）= F×OD280×D 式中：OD280为被测溶液在280nm 紫外波长下的光密度，D 为溶液的稀释倍数。

25. 第二节 氨基酸的测定 • 目前氨基酸的主要测定方法： • 容量法； • 比色法； • 色谱法； • 薄层层析法； • AA分析仪法、HPLC法。 • 荧光法； • 电化学法； • 化学发光法； • 在碱性介质中,谷氨酸对硫氰化钾 -鲁米诺化学发光体系有增敏作用。 • 红外光谱法等。

26. 氨基酸分析的一般过程 • 待测定液的制备 • 游离氨基酸的浸提； • 全氨基酸组分测定时蛋白质的水解。 • 测定 • 标样的准备； • 各氨基酸组分的测定

27. 游离氨基酸的浸提 • 液体试样(包括含CO2或酒精性饮料)直接取样或适量稀释后取样; • 果蔬试样直接榨汁或用组织捣碎机捣成匀浆，取5~1g(或ml)于50ml或100ml量瓶内，加30%H2O2 3~5滴，水稀释至刻度(若溶液浑浊，离心或滤纸过滤)待测定。 • （有的分析要求用乙醇浸提）

28. 全氨基酸组分测定样品的水解 • 准确称取样品0.1 ~ 0.2g于18  20mm硬质玻璃试管中，加6mol/L HCI及十氢萘1滴。在酒精喷灯上将试管上部3~4cm处拉成2~smm的细颈(如图1所示)。抽真空15min，真空下封管，于110士1℃水解16~18h。水解完成后定容至50mL。静置橙清取清液lmL用Sep-Pack C18预柱滤于50mL烧杯中。在65℃水浴上蒸干，加两滴去离子水再蒸干，冷却后加2~5mL 0.02mol/L HCI，然后上机测定。 含硫氨基酸（如胱氨酸和色氨酸）易分解，需专门的水解步骤进行。

29. 氨基酸分析样品水解方法之二 • 1.一般水解程序 • 取含蛋白质约10mg的量→置于水解管→6 mol·L-1 HCl 10mL（液体样加等量的浓盐酸）→脱气其密封→110℃水解22h→水解管开封→旋转蒸发器去除盐酸→干涸后，用蒸馏水溶解→ 50℃以下再次干涸→溶于10mL 的柠檬酸钠缓(pH-2)冲溶液中→ 上机分析。

30. 氨基酸分析样品水解 2. 胱氨酸及色氨酸的水解。 • (1) 胱氨酸：将含有胱氨酸 0.25~1.00 mol的试样溶于88%甲酸10mL 中 →取此试样溶液 0.5mL 置于具塞试管中→ 加入过甲酸溶液(30%H2O2和88%甲酸按溶积1∶9的比例混合，室温下放置1h后使用)2mL → 在0℃下放置4h →旋转蒸发器去除过甲酸→用含2~4% -巯基乙醇的6mol·L-1 HCl溶液按上步骤水解。 • (2) 色氨酸：取含色氨酸1~2mg试样→聚乙烯管中， 将此管封在玻璃管中 →加入4.2mol．L-1氢氧化钠溶液100mL和 硫代二甘醇0.3mL →脱气封管→ 110℃下水解24h →分解物用 6mol·L-1 HCl 7mL中和→再用pH4.2的柠檬酸缓冲溶液调整pH 为4.5，定容至一定量。

31. 氨基酸分析样品水解 • 3. 植物性产品水解 • 取粉碎样20~50g 置于最终浓度为750mL·L-1乙醇中→取10mL均化器均质→移入茄形烧瓶中→ 80℃加热回流15min →泠却→瓷漏斗过滤→残渣用75%乙醇50mL再提取两次，滤液合并定容至250mL，在-20℃下放置一夜[有沉淀时，用玻璃过滤器(G-3)过滤或离心分离(6000r·min-1，10min) ]→旋转蒸发器去除水分， →干涸物溶于试样稀释用的缓冲溶液中。

32. 氨基酸分析仪的一般程序 • (1)样品的水解。 • (2) 试样中氨基酸浓度的估量，上机分析氨基酸浓度1~10nmol/50l范围为宜。 • (3)分析前的仪器检查：一般有水浴及反应槽的温度，泵的流速，缓冲液，茚三酮试剂以及N2气压力等仪器的各种性能检查。 • (4)设定分析程序——按仪器说明书推荐使用的分析程序操作。 • (5) 分析混合氨基酸标准样层析图谱的各种参数。 • (6) 试样的分析：最后仪器分析试样，打印出全氨基酸的色谱图，以绘出各氨基酸组分的纳克数。然后将按试样的质量，稀释倍数及试样水分系数等，计算其结果。

33. O +HCHO NaOH R-C-C R-CH-COOH R-CH-COONa R-CH-COOH H3N-O NH2 N=CH2 N=CH2 氨基酸总量的测定——甲醛滴定法 • 方法原理 氨基酸具有酸性的-COOH和碱性的-NH2，它们互相作用使氨基酸成中性的内盐。加入甲醛时， NH2与甲醛结合，其碱性消失，这样就可以用酚酞作指示剂，以标准碱来滴定-COOH，用间接的方法测定氨基酸的含量。

34. 甲醛法测定氨基酸的评述 • 作为定量方法，我国推荐甲醛值法作为标准方法，该法虽有较好准确度，但存在以下间题: • 方法的灵敏度低，尤其是对饮料中原汁含量较低的样品，往往检不出;对含碳酸型及酒精型的饮料，需除去CO2和乙醇才能测定;滴定终点不易掌握，甲醛浓度滴定速度等要求苛刻;取样量大、分析速度慢、消耗溶剂多。 • 色深样品需用电位滴定等。

35. 氨基酸总量的测定——茚三酮比色法 • 方法原理 氨基酸在一定pH条件下与水合茚三酮反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。

36. 氨基酸分析仪法 • 方法原理： 氨基酸分析仪的中心是离子交换层析柱，当流动相(缓冲溶液)推动氨基酸流经装有阳离子交换树脂的色谱柱时，氨基酸与树脂中的交换基团进行离子交换，当用不同pH值的缓冲溶液进行洗脱时，因交换能力的不同而将氨基酸混合物分开，流出色谱柱的氨基酸再与茚三酮在100℃下反应生成紫色物质茚二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，显色后的氨基酸由光度计检测。 大多数氨基酸与茚三酮均有此反应，所形成的DYDA在570nm处有最大的吸收峰。但脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质，在440nm处有一吸收峰，通过光度计对这两个波段的检测，由记录器给出层析图谱，附有数据处理机的氨基酸自动分析仪可直接给出50g样品中含有各种氨基酸的纳克(ng)数。

37. 茚三酮 缓冲液1 缓冲液2 缓冲液3 缓冲液4 再生液 氨基酸分析仪工作流程 电磁阀 多支管 泵 混合器 反应槽 比色计 记录仪

39. 蛋白质水解物分析用缓冲溶液

40. 水合茚三酮配制表

41. 氨基酸的分离与鉴定——薄层层析法 • 方法原理 水解样液滴在微晶纤维板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，由于氨基酸的吸附力和Rf值不同而分离，用茚三酮喷雾显色，与标准氨基酸图谱相比较进行定性和定量。 • 操作： 15g 微晶纤维素+30mL水+4mL丙酮→匀浆后涂成0.5mm厚板（玻璃板200×200mm,厚3mm) →取水解样5微升点样→先进行碱展开→翻转90度→酸展开→茚三酮显色→与标准图谱相比定性和定量。 其它分析方法： 气相色谱法——转化三氟乙酰基二丁酯后上机。 液相色谱法——丹磺酰氯进行衍生化后溶于流动相中，上机测定。

42. AAS法测水溶性氨基酸总量 • 方法原理： 用甲基异丁酮和丁醇的混合溶剂萃取样品，，再用难溶性的Cu3(PO4)2与氨基酸反应，生成溶于水的氨基酸Cu络合物，离心沉降未反应的Cu盐，用原子吸收法测定上层清液中的Cu可间接测定茶叶中的氨基酸。（本方法所得结果与分光光度法的结果非常一致。） Cu3(PO4)2悬浮液：将CuCI2和Na3PO4溶液混合，按倾泻法制备。

43. 谷物和饲料中赖氨酸的测定——染料结合赖氨酸法-DBL法) • 方法原理 • 染料结合法可用于测定样品中蛋白质的碱性氨基酸，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。如果先将样品用丙酸酐处理，丙酸酐便将赖氨酸的-NH2的酰化掩蔽，使其失去了和染料结合的能力。 其反应如下： O O  赖氨酸的—NH2 + CH3—CH2—C—O—C—CH2—CH3  O 丙酸酐  —HN—C—CH2—CH3 + CH3—CH2—COOH 丙酰 丙酸 • 然后分别测定酰化前后的DBC值。酰化前的测定值为赖氨酸+组氨酸+精氨酸。而酰化后只是组氨酸+精氨酸。 • 以上两项测定结果的差值，就可计算出赖氨酸的含量。

44. 谷物、油料籽粒的称样量

45. ε -TNP-赖氨酸（黄色） γ -TNP-赖氨酸 TNPS 谷物和饲料中赖氨酸的测定——TNBS法) • 方法原理 2,4,6-三硝基苯-1-磺酸（TNBS）与赖氨酸结合后溶液中有三种物质： 乙醚萃取，弃醚层 水相除醚后， 346nm处比色测定 溶于乙醚

46. 色氨酸的测定—乙醛酸法 • 方法原理： 谷物中蛋白质经木瓜蛋白酶作用水解出色氨酸，然后在浓硫酸存在的情况下，Fe3+可将乙酸氧化为乙醛酸，2mol色氨酸能与1mol乙醛酸缩合，产生Hopkins-cole反应，生成红紫色的化合物，其红紫色的强度与色氨酸的含量在一定范围内成正比，其最大的吸收峰在545nm，可进行比色测定。 • 要点： 冰醋酸中必须含有低量的乙醛和高含量的乙醛酸，否则不形成颜色，可在混合显色剂中加入的80mL·L-1乙酸酐，解决显色问题。