200 likes | 336 Vues
ELVÃLASZTÃSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor VIII. AFFINITÃSI KROMATOGRÃFIA AFFINITY CHROMATOGRAPHY (AFF) EÖTVÖS LORÃND TUDOMÃNY EGYETEM Budapest – 2013. AFFINITÃSI KROMATOGRÃFIA. ALAPELV
E N D
ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor VIII. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA AFFINITY CHROMATOGRAPHY (AFF) EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013
AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA • ALAPELV • Kovalens kötéssel (általában köztes láncon keresztül - spacer, leash, tentacle) hordozó szemcsékre (mátrix) rögzített • különböző funkcionális csoportok (ligandum), amelyek • Az elválasztandó (bio)molekulával specifikus és reverzibiliskölcsönhatásokat képeznek. • A hordozó szemcsék anyaga (mátrix) lehet: • - Poliszacharidok: agaróz (Sepharose, Superose) • cellulóz • - Organikus polimerek: • poliakrilamid • hidroxialkil metakrilát (Spheron) • etilénglikol metakrilát (Fractogel) • - Kevert fázisok (agaróz-poliakrilamid) (Ultrogel) • - Szilikagél, "porózus üveg" (SelectiSphere)
Az affinitási kromatográfia kölcsönhatásainak tükörképi elve
AFFINITÁSI KÖLCSÖNHATÁSOK (IMMOBILIZED LIGAND AFFINITY TECHNIOUES) IMMUNOAFFINITY (immunosorption) LECTINS (glycoproteins, oligo-polysaccharides) HORMONES (receptors/carriers/antihormones) PROTEINS (enzymes, immunoglobulins) SUBSTRATES (cofactors, inhibitors, modulators) NUCLEIC ACID binding ligands (oligo(dT)cellulose) VÍRUS binding ligands PHENYL BORONATE binding (cis-diols) IMMOBILIZED METAL ION binding affinity DYE-LIGAND binding affinity - Cibacron Blue F3G-A - Malachit Green (A/T specific) - Phenol Red (G/C specific)
AAT Glicin-HCl puffer, pH: 2,8 perc
LECTIN-affinitási kromatográfia lektinek affinitási kölcsönhatásai glikoproteinekkel - glikánokkal • N-glikozid kötésben • Lectin-AAA • Lectin-DSA • Lectin-GNA • Lectin-MAA • Lectin-SNA • Lectin-PHA-L • Szerkezet specificitás • L-Fuc(l-6)GIcNAcl • Galβ(l-4)GlcNAc- • Man (l-3)62 Man- • SA (2-3)Gal • SA (2-6)Gal • Poly-Gal-GlcNAc- • O-glikozidos kötésben • Lectin-ACA • Lectin-PNA • Lectin-ConA • Lectin-RCA-120 • Lectin-WGA SA(2-3)Galβ(l-3)-GalNAc-Ser/Thr Galβ(l-3) GalNAc-Ser/Thr
AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Ready-to-use group specific adsorbents
Sejtmembrán glikoprotein (Na-deoxikolát extraktum) tisztítása L. culinaris lectin-Sepharose 4B oszlopon
FESTÉK LIGANDUM AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY
DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS • FUNCTIONAL GROUP: CIBACRON BLUE F3G-A • AFFINITY PACKING MATERIALS: • (Capacities 10 mg albumin per ml gel) • ~ Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia) • ~ Affi-GelR Blue Gel (Bio-Rad) • ~ Fractogel TSK AF-Blue (Merck), TOYOPEARL AF Blue HC-650M • COLUMN: 6x0.5cmI.D. (Pharmacia 5/5) • CHROMATOGRAPHIC SYSTEM: FPLC (Pharmacia) with LCC-500 Programmer and UV-1 Monitor (278 nm) • ELUTION: • Equilibrated and eluted with 10 mM phosphate buffer • pH: 5.8 or 6.8 • Step gradient elution with 10 mM phosphate buffer • pH:8.0 containing 2 M NaCl • FLOW RATE: 1 ml / min • SAMPLE: 500 μL ~ prepared by Sephadex G-25 • Equivalent to 50 μL of original serum
DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS COLUMN: Blue Sepharose CL-6B pH:5,8 Human serum samples prepared by Sephadex G-25
PSEUDO-URIDINE DETERMINATION • PRINCIPLE • NUCLEOSIDES (PSEUDO-URIDINE) WITH VICINAL HYDROXYL GROUPS IN THEIR STRUCTURE CAN BE EXTRACTED SELECTIVELY BY AFFINITY CHROMA-TOGRAPHY FROM COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES AND SEPARATED BY REVERSED-PHASE HPLC. • SAMPLE PREPARATION • MICRO-PREPARATIVE BORONATE AFFINITY COLUMN (Affi-Gel 601, Bio-Rad Labs, 5x50 mm) WAS EQULIBRATED WITH 0.25M NH4-ACETATE (pH 8-8). ONE ml URINE WAS MIXED WITH 0.3 ml 2.5M NH4-ACETATE (pH 9.5) AND CENTRIFUGED. 500 μL SUPERNATANT WAS APPLIED ON THE AFFINITY • COLUMN AND WASHED WITH 2x4 ml 0.25M NH 4 - ACETATE (pH 8.8). ELUTION WAS PERFORMED WITH 5 ml 0.1M FORMIC ACID. ELUATE WAS COLLECTED AND FREEZE-DRYED. THE RESIDUE WAS SOLVED IN 250 μL 10mM NH4~PHOSPHATE (pH 5) CONTAINING 2 % METHANOL. • HPLC ANALYSIS • HP 1084B LIQUID CHROMATOGRAPH ISOCRATIC ELUTION WITH 10mM PHOSPHATE BUFFER (pH 5.1) CONTAINING 2% (v/v) METHANOL., • COLUMN: ODS-HYPERSIL (25x0.46 cm, 5u) TEMP: 35°C. FLOW: 1 ml/min. • DETECTION: 254 nm.