VI Simpósio ABRAPA São Paulo – 15 de junho de 2007 Silvana do Couto Jacob

1. PASSO A PASSO DO PROCESSO DE VALIDAÇÃO PARA MÉTODOS QUÍMICOS VI Simpósio ABRAPA São Paulo – 15 de junho de 2007 Silvana do Couto Jacob Laboratório de Alimentos e Contaminantes - DQ INCQS / FIOCRUZ

2. RESULTADO ANALÍTICO – PARA QUÊ? Tomada de decisão nas diversas áreas. Para isso temos que gerar “resultados aceitáveis” Ex. Limite máximo de Cd em solo = 5 mg / Kg Resultado analítico Laboratório 1: 4,5 mg / Kg com incerteza de +/- 0,5 Laboratório 2: 4,5 mg / Kg com incerteza de +/- 0,8 Laboratório 2 incorrendo certo risco de erro ao afirmar que a amostra atende a exigência prescrita em lei. Resultado com apenas a média é difícil comparação, tomar a decisão. Com a incerteza podemos tomar a decisão correta.

3. METROLOGIA QUÍMICA OBJETIVO: conseguir alta exatidão com mínimo de incerteza. COMO ? Garantindo que todas as etapas de um procedimento químico sejam comparáveis a um padrão de medição de referência aceitável. Medições químicas requerem vários estágios : amostragem, digestão, extração, etc. sendo essencial que se tenha o entendimento pleno das incertezas que são introduzidas em cada etapa do procedimento analítico. MEDIR = COMPARAR

4. RASTREABILIDADE DAS MEDIÇÕES • Um dos temas mais importantes na química analítica – assegura que medições feitas em diferentes laboratórios e períodos sejam comparadas. É a propriedade de um resultado de medição, o qual está relacionado a padrões apropriados, geralmente nacionais ou internacionais, por meio de uma cadeia contínua de comparações, todas tendo incertezas estabelecidas.

5. VALIDAÇÃO DE UM MÉTODO • Comprovação através de evidência objetiva, de que os requisitos para uma aplicação ou uso específico pretendido foram atendidos Quais métodos validar? • Não normalizados • Criados/ desenvolvidos pelo laboratório • Normalizados usados fora dos escopos para os quais foram concebidos • Ampliações e modificações de métodos normalizados

6. PLANEJAMENTO DA VALIDAÇÃO • Definição da aplicabilidade do objetivo e do escopo do método • Definição de parâmetros de desempenho e critérios de aceitação – baseada no objetivo de cada método e no princípio básico de medição que este utiliza custo X benefício (PM)

7. PARÂMETROS NECESSÁRIOS -escolhidos de acordo com o tipo de método • Linearidade • Recuperação • Limites de detecção e quantificação • Exatidão • Precisão • Seletividade • Controle do processo em rotina (garantia da qualidade interna)

8. PARÂMETROS NECESSÁRIOS para validação – segundo (FDA -1995 / WHO - 20050 Obs* necessária em análises de traços

9. Critérios de aceitação para os parâmetros estudados • Acordado pelo laboratório e cliente • No caso de testes estatísticos (hipóteses) estes critérios já estarão definidos dependendo do teste específico escolhido para um dado nível de confiança (1 - α) ou de significância (α) • (teste Fisher, t de student, análise de variâncias) • Outros casos estabelecer através da literatura , resultados interlaboratoriais, métodos similares ou experiência acumulada • Testes que usam kits ou imunoensaios – falso x positivo) obtido na literatura especializada.

10. PARÂMETRO DE DESEMPENHOEXATIDÃO

11. PARÂMETRO DE DESEMPENHOPrecisãorepetitividade /reprodutibilidade e Precisão intermediária* *Não há necessidade de avaliação da precisão intermediária quando for realizado o teste da reprodutibilidade

12. PARÂMETRO DE DESEMPENHOPrecisãorepetitividade /reprodutibilidade e Precisão intermediária* • Um mínimo de 9 determinações cobrindo a faixa específica para o procedimento (p. ex: 3 concentrações/3 replicatas cada, menor, intermediária e maior); ou • Um mínimo de 6 determinações a 100 % de concentração teste • Calcular o desvio padrão, o desvio padrão relativo ou coeficiente de variação ou a variância. • GUIDANCE FOR INDUSTRY Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodology U.S. Department of Health and Human Services, • Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics evaluation and Research, November 1996 ICH.

13. PARÂMETRO DE DESEMPENHOPrecisãorepetitividade /reprodutibilidade e Precisão intermediária* • REPETITIVIDADE • Um mínimo de 9 determinações cobrindo a faixa específica para o procedimento (p. ex: 3 concentrações/3 replicatas cada, menor, intermediária e maior); ou • Um mínimo de 6 determinações a 100 % de concentração teste • Calcular o desvio padrão, o desvio padrão relativo ou coeficiente de variação ou a variância. • GUIDANCE FOR INDUSTRY Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodology U.S. Department of Health and Human Services, • Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics evaluation and Research, November 1996 ICH.

14. PARÂMETRO DE DESEMPENHOPrecisãorepetitividade /reprodutibilidade e Precisão intermediária* PRECISÃO INTERMEDIÁRIA Os resultados dos dados obtidos em dias alternados, por um mesmo analista, usando um mesmo equipamento, mesmas concentrações e mesma metodologia, deverão ser o mesmo: pode ser comprovado por teste t, onde a hipótese a ser afirmada é que o resultado obtido em diferentes dias são significativamente iguais. Hipótese a ser testada: Ho: 1= 2 Teste t T=( - xmed)n/S onde: =valor de referência, xmed=média dos valoresdos resultados de análise, n=número de resultados de análise e S=desvio padrão O valor crítico (tabelado) varia em função do grau de liberdade () e do nível de confiança, sendo que: = n – 1 se: ttab > tcalc  Ho é aceita ttab  tcalc  Ho é rejeitada GUIDANCE FOR INDUSTRY Q2B. Validation of Analytical Procedures: Methodology U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics evaluation and Research, November 1996 ICH.

15. PARÂMETRO DE DESEMPENHOPrecisãorepetitividade /reprodutibilidade e Precisão intermediária* REPRODUTIBILIDADE É o grau de concordância entre os resultados das medições de um mesmo mesurando, efetuadas sob condições variadas de medição(VIM). A reprodutibilidade não é um componente de validação de método executado por um único laboratório, é obtido em relação aos dados de validação obtidos através de comparação interlaboratorial (INMETRO, 2002). INMETRO. Orientações sobre validação de métodos de ensaio químicos. VIM – Vocabulário Internacional de termos Fundamentais e Gerais de Metrologia, 1995.

16. PARÂMETRO DE DESEMPENHOEspecificidade / seletividade

17. PARÂMETRO DE DESEMPENHOEspecificidade / seletividade SELETIVIDADE O cálculo do valor de t quando se comparam médias de duas amostras diferentes é dado pela expressão - x x 1 2 t = + Sa 1 / n 1 / n 1 2 Saé a estimativa do desvio padrão agregado, calculado a partir das estimativas dos desvios-padrões das duas amostras Sa =

18. PARÂMETRO DE DESEMPENHOLimite de Detecção

19. PARÂMETRO DE DESEMPENHOLimite de Detecção O limite de detecção do equipamento (LDE) é definido como a concentração do analito que produz um sinal de três a cinco vezes a razão ruído/sinal do equipamento. O limite de detecção do método (LDM) é definido como a concentração mínima de uma substância medida e declarada com 95% ou 99% de confiança de que a concentração do analito é maior que zero. O LDM é determinado através de análise completa de uma dada matriz contendo o analito.

20. PARÂMETRO DE DESEMPENHOLimite de Detecção O limite de detecção foi determinado analisando 6 vezes a menor concentração da curva analítica, e o desvio padrão foi multiplicado por 3, este limite é referente a alíquota de análise. Tem que se considerar o procedimento do método para se determinar o limite de detecção do método. Desvio padrão: é igual a raiz quadrada positiva da variância e tem a mesma dimensao da média aritmética s =  (xi – xmédio)2 x 1/(n-1) THOMPSON, M., ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p. 835-855, 2002.

21. PARÂMETRO DE DESEMPENHOLimite de Quantificação Alguns organismos internacionais (UKAS- 2002), consideram o LQM, o Limite inferior da curva analítica.

22. PARÂMETRO DE DESEMPENHOLimite de Quantificação • É a mais baixa concentração da substância em exame que pode ser quantificada com certo limite de confiabilidade utilizando um determinado procedimento experimental • Geralmente é o mais baixo ponto da curva analítica não deve ser • determinado por extrapolação • UKAS PUBLICATION ref: LAB 27, United Kingdom • Accreditation Service. www.ukas.com

23. PARÂMETRO DE DESEMPENHOSensibilidade

24. PARÂMETRO DE DESEMPENHOSensibilidade Descreve quanto a resposta varia com a variação da concentração do analito. Pode ser expressa como a inclinação da curva analítica (coeficiente angular), expresso pala equação S=dx/dc, onde: dx = variação da resposta, dc = variação da concentração É medida ao mesmo tempo que testa a linearidade Depende da natureza do analito e da técnica de detecção BRUCE, P. , MINKKINEN, P. , RIEKKOLA, M. L. Practical Method Validation: Validation sufficient for an Analysis Method. Mikrochimica ACTA. V. 128, p. 93-106, 1998.

25. PARÂMETRO DE DESEMPENHOFaixa de trabalho e Faixa linear de trabalho

26. PARÂMETRO DE DESEMPENHOFaixa de trabalho e Faixa linear de trabalho • A faixa de trabalho (FT) pode ser definida entre um décimo a • dobro do limite de restrição (LR) • 0,1 LR ≤ intervalo de trabalho ≤ 2 LR • Exemplo: • Como o limite máximo (de restrição) estabelecido para um dado contaminante • Hg em pescado 0,5 mg / Kg,é a faixa de trabalho para se trabalhar deve ser de: • 0,05 mg / Kg ≤ FT ≤ 1,0 mg / Kg • OBS. Considerar quanto de amostra será pesada e quanto será pipetada (injetada ) • no aparelho.

27. PARÂMETRO DE DESEMPENHOLinearidade Pode-se verificar se algum ponto de concentração desvia da linearidade da curva por meio do cálculo dos resíduos entre os valores medidos e os valores calculados a partir da equação da curva. Calcular um ponto duvidoso de uma curva analítica pelo valor de t. tcalculado= resíduo sr/n Onde: resíduo =|xmedido - xcalculado| sr=desvio padrão dos resíduos =   (xmedido – xcalculado)2 n - 2

28. PARÂMETRO DE DESEMPENHOLinearidade • Coeficientes de correlação r e determinação R2 • Homocedasticidade/heterocedasticidade • É a independência ou dependência da variância das respostas com as concentrações do analito • ATENÇÃO!!!!! • “Lack - of - fit” ( falta de ajuste) Avaliação se existe algum valor aberrante nos resíduos que são deslovamentos de Y em relação à curva analítica: • deve-se verificar o ajuste ao modelo “normal” • checar a não - linearidade em um gráfico de regressão.

29. PARÂMETRO DE DESEMPENHORobustez

30. PARÂMETRO DE DESEMPENHOrobustez • Comparação de resultados ( médias) de resultados obtidos a • partir de pequenas variações nos parâmetros do método como: • Temperatura, • Tempo de pirólise - AAS • Concentração de um dado reagente usado para extração • Quantidade da amostra injetada • Quantidade de amostra pesada • Até quanto a modificação pode ocorrer e o método ser usado?

31. PARÂMETRO DE DESEMPENHOincerteza

32. INCERTEZA DE RESULTADOS • Avaliada por meios estatísticos através da variação dos fatores dos quais depende este resultado. • É um parâmetro associado ao resultado de uma medição, que caracteriza a dispersão dos valores que podem ser atribuidos a um mensurando como desvio padrão. INCERTEZA = DÚVIDA

33. VERIFICAÇÃO DE PROBLEMAS - INCERTEZASdiagrama de causas e efeitos (diagrama de espinha de peixe) método Pessoal qualificação treinamento Desvio do resultado analítico Validação adequação Contaminação padronização Manutenção calibração Reagentes Equipamentos

34. Resultados analíticos • decisões importantes • Importante: qualidade do resultado garantir que a informação seja adequada

35. Química analítica requisito formal para estabelecer a confiança nos resultados:resultado deve ser rastreável a uma dada referência (SI, MR ou um método empírico) ISO 17025:1999demostração da qualidade dos resultadosdemonstrar da sua adequação aos fins a que se destinam

36. Incerteza da mediçãoé a medida da confiança que pode-se depositar no resultado analíticoé a medida da qualidade do resultado Conceito à muito conhecido mas somente em 1993 a ISO em colaboração com outras organizações Publicou o “Guia para Expressão da Incerteza da Medição” 1995 – 1º edição do Guia da EURACHEM “Quantificação da Incerteza nas medições Analíticas” 2000 – 2º edição do Guia da EURACHEM

37. INCERTEZA Definição Dúvida sobre um resultado, sobre sua validade, sobre sua exatidão X ± U (p%)

38. Erros X Incertezas Resultado de análise: 2,5 ± 0,8 mg / Kg Valor certificado: 2,9 ± 0,2 mg / Kg Erro: 2,9 – 2,5 = 0,4 mg / Kg Incerteza: 0,8 mg / Kg

39. Erros X Incertezas Erro diferença entre resultado individual e o valor verdadeiro Incerteza Um parâmetro* associado com o resultado de uma medição, que caracteriza a dispersão** dos valores que poderiam razoavelmente ser atribuidos ao mensurando * mensurando: concentração do analito, pH, densidade, etc ** dispersão: desvio padrão ou seus múltiplos, intervalo de confiança, amplitude, etc.

40. Incerteza da medição • Um resultado pode estar muito próximo do valor“verdadeiro” • Existemerros aleatórios • Sem a expressão da incerteza o analista não sabe quão próximo o resultadose encontra dovalor esperado

41. DÚVIDA PARA APROVAR OU REPROVAR ITENS QUE SE ENCONTRAM COM VALORES PRÓXIMOS DOS LIMITES DE CONFORMIDADE Limite inferior da especificação Limite superior Da especificação ZONA DE NÃO CONFORMIDADE ZONA DE NÃO CONFORMIDADE ZONA DE CONFORMIDADE ZONA DE INCERTEZA ZONA DE INCERTEZA

42. DÚVIDA NA RESPOSTA ISO 14253-1- aplicada a metrologia dimensional • Zona de conformidade: tolerância da especificação subtraída da incerteza da medição em cada extremidade • Zona de não conformidade: áreas externas à tolerância da especificação adicionando-se o valor da incerteza da medição em cada extremidade • Zona de incerteza: área onde a conformidade e não conformidade podem ser determinadas

43. Incerteza e limites de conformidade Versão português Guia Eurachem 2º ed./COTAC

44. Resultado analítico Estimativa confiável da incerteza são essenciais para a tomada de decisões Deve ser acordado entre cliente e laboratório quais itens devem ser aprovados SAÚDE PÚBLICA deve-se avaliar RISCO X BENEFÍCIO

45. SAÚDE PÚBLICA - RISCO X BENEFÍCIO Exemplo: Determinação de timerosal em vacinas Valor máximo permitido: 200 mg / Kg Timerosal em excesso – risco à saúde Timerosal em menor quantidade – afeta a qualidade do produto e assim, leva ao risco Deve-se avaliar risco x eficácia

46. INCERTEZAS DOS RESULTADOS ANALÍTICOS E AVALIAÇÃO DO ENSAIO REALIZADO ALIMENTOS: Declaração Nutricional Obrigatória – faixa de aceitabilidade ± 20%d.d. Aditivos intencionais - Teor máximo permitido Pesticidas / contaminantes – limites máximos permitidos limite mínimo de desempenho requerido MEDICAMENTOS: Teor dos princípios ativos - nas monografias Oficiais, a faixa de aceitabilidade dependente da substância ativa. Ex. ± 5% d.d. ± 10% d.d. ± 15% d.d.

47. INCERTEZAS DOS RESULTADOS ANALÍTICOS E AVALIAÇÃO DO ENSAIO REALIZADO • THE COMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES • Objetivo : estabelecer normas para a comunidade europeia. • Decisões de 12 de agosto de 2002 (2002/657/EC) • discutir e aprovar regras para os metodologias analíticas • a serem usadas em testes de amostras oficiais e • especificar criterios comuns para a interpretação dos resultados • analíticos dos laboratórios Oficiais de Controle

48. INCERTEZAS DOS RESULTADOS ANALÍTICOS E AVALIAÇÃO DO ENSAIO REALIZADO Assuntos tratados no documento: Definições Analytical methods Minimum required performance limits Quality control Interpretation of Results Repeal Transitional provisions Data of application Addresses

49. INCERTEZAS DOS RESULTADOS ANALÍTICOS E AVALIAÇÃO DO ENSAIO REALIZADO “Power curve” – fornece informações sobre a capacidade de detecção do método num escolhido intervalo de concentração. (Isto refere-se a um risco de beta –erro quando aplica-se tal método) Permite calcular a capacidade de detecção para respectivas categorias de metodos para um um certo erro beta

50. INCERTEZAS DOS RESULTADOS ANALÍTICOS E AVALIAÇÃO DO ENSAIO REALIZADO erro alfa - probabilidade da amostra analisada ser conforme apesar de se ter obtido resultado não conforme(falso positivo) erro beta - probabilidade da amostra analisada ser não conforme apesar de se ter obtido resultado conforme(falso negativo) CCbeta - capacidade de detecção é o teor mais baixo que pode ser detectado , identificado ou quantificadocom uma probabilidade de erro “beta”. Ccalfa - limite de decisão é o limite a partir do qual pode-se decidir se uma amostra é não conforme com uma probabilidade de erro “’alfa”.