§4 基因克隆的载体系统

1. §4基因克隆的载体系统 • 4.1 质粒（plasmid）载体 • 大肠杆菌主要的天然质粒类型： ① F 质粒：致育因子或性因子 ② R 质粒：抗药性因子 ③ Col 质粒：产生大肠杆菌素因子 • 基因工程中使用的质粒载体都是在天然质粒的基础上人工改造而成的。质粒载体是重组DNA研究中最常用的也是最重要的基因克隆载体。

2. 4.1.1 质粒的生物学特性 • 4.1.1.1 质粒DNA及其构型 • 绝大多数质粒都是环状双链DNA分子 • 质粒DNA的构型： • SC 构型：由cccDNA呈现超螺旋而形成； • OC 构型：开环DNA（ocDNA）的构型； • L 构型：双链断裂而形成的线性质粒 DNA分子。

4. （2）F质粒及起接合转移：详见遗传学相关内容（2）F质粒及起接合转移：详见遗传学相关内容 • 4.1.1.2 质粒DNA的转移 • （1）质粒的类型 • 接合型质粒：能够自主转移的质粒。 • 非接合型质粒：不能自主转移的质粒。

5. 4.1.1.3 质粒DNA的迁移作用 • 由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程 • ColE1质粒的迁移： • 2个相关基因： bom：ColE1 DNA 上的特异位点，是 Mob基因产物的作 用位点； mob：其产物是 ColE1 质粒特有 的弥散产物—核 酸酶，作用于 bom位点。

6. 4.1.1.4 质粒DNA的复制类型 • 质粒拷贝数：（1）生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含的质粒DNA分子的数目；（2）对应于每条细菌染色体平均具有的质粒DNA分子数目。 • 严禁型质粒和松弛型质粒 严禁型质粒：低拷贝数的质粒，每个寄主细胞仅含有 1~3拷贝； 松弛型质粒：高拷贝数的质粒：每个寄主细胞中可高 达10~60份 • 质粒的结合转移能力，同它们的分子大小及复制类型之间有一定的相关性：接合型质粒由于具有较高的分子量，一般属于严禁型的；而非接合型质粒往往具有较小的分子量，一般属于松弛型质粒。

7. 4.1.1.5 质粒的不亲和性（不相容性） • 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一个寄主细胞内稳定地共存的现象。 • 彼此间不亲和的质粒属于同一个不亲和群；而彼此间能够共存的质粒属于不同的不亲和群。

9. 质粒不亲和现象的图解

10. 4.1.2 质粒DNA的分离和纯化 • 为了在基因克隆中用作载体分子，要获得批量的纯化的质粒DNA分子。加入溶菌酶或SDS（十二烷基硫酸钠）来裂解大肠杆菌细胞，在从细菌细胞内分离得到质粒DNA，然后在进一步纯化质粒DNA，使其没有细菌染色体DNA片段、RNA、蛋白质等杂质的污染。 • 4.1.2.1 碱变性法 • 原理：在pH12.0~12.5范围内，线性DNA分子会被变性，成为线性单链分子；而质粒cccDNA的互补的两条链仍会紧密地结合在一起。在酸中和时，质粒DNA分子的两条链的复性迅速而准确，而随机断裂的线性DNA分子复性不会那么快速而准确，它们聚集成网状结构，在下一步的离心分离时与变性的蛋白质与RNA一道沉淀下来，滞留在上清液中的质粒cccDNA用酒精或异丙醇等试剂沉淀收集。

11. 简要操作过程（投影） • 4.1.2.2 微量碱变性法 如果质粒DNA需求量不多的情况下（或高拷贝质粒）可采用此种方法。此方法具有快速简便、经济实惠等优点，还可以同时抽提几种质粒DNA。方法同大量提取法相近。 • 4.1.2.3 氯化铯（CsCl）密度剃度离心法 如果实验需要高纯度、高质量的质粒DNA，可采用这种方法离心纯化质粒DNA 。由于在离心管中还要加入溴化乙锭溶液，所以也叫氯化铯-溴化乙锭密度剃度离心法。 在超速（或高速）离心状态下，氯化铯在离心管中形成密度剃度，而细菌裂解液或质粒溶液中的不同成分按其密度在氯化铯的不同密度层面分离存在，从而达到分离纯化的目的。

13. 4.1.2.4 影响质粒DNA产量的因素 • （1）寄主菌株的遗传背景 • （2）质粒的拷贝数及分子大小 • （3）实验操作误差

14. 4.1.3 质粒载体的构建及类型 • 4.1.3.1 天然质粒的局限性 天然质粒在抗生素标记、限制性内切酶酶切位点、分子量、拷贝数等等很多方面不能满足基因克隆的要求，所以绝大部分质粒载体是在天然质粒的基础上根据基因工程的需要而改造而来的。 • 4.1.3.2 质粒载体必备的条件 1、具有复制起点 2、具有抗菌素抗性基因（理想情况下2种抗性基因） 3、具有若干个限制酶单一识别位点 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数

15. 4.1.3.3 质粒载体的选择性标记 • （1）负选择标记

16. （2）正选择体系 • ① 丧失四环素抗性标记的正选择体系 • 具有四环素抗性标记的细胞对亲脂的螯合剂—萎蔫酸极其敏感，因此能够在含有萎蔫酸的培养基中生长的只能是四环素敏感的细胞，而不是四环素抗性的转化子。 • 将外源DNA片段克隆到载体的四环素抗性基因（tetr）内某个限制位点上，使后者发生插入失活，并使用含萎蔫酸的培养基进行正选择。这样获得的抗药性群体全都可能含有插入的外源DNA片段。 • ② 环丝氨酸富集法 • 环丝氨酸是氨基酸类似物，如果在细胞生长分裂过程中参入到新合成的蛋白质多肽链，则会导致细胞的死亡。因此，在含有四环素的培养基中环丝氨酸只能杀死生长的Tetr细胞，而对于停止生长的Tets细胞则无致死效应。

17. 环丝氨酸富集法 • 由tetr基因内带有插入序列的重组质粒所转化的大肠杆菌细胞，在含有氨苄青霉素的培养基初步筛选以后，经过一次环丝氨酸处理，存活的细胞中Tets细胞所占比例得到明显的提高，再经若干次重复处理， Tets细胞的富集则可上升数倍。

18. 4.1.3.4 质粒载体的类型 • ⑴ 高拷贝数的质粒载体 • 在没有蛋白质合成的条件下仍能复制，具有低分子量、高拷贝数的特点。在基因工程中用于分离大量的高纯度的克隆基因DNA片段。通常选用Col1、Pmb1或它们的派生质粒。 • 通常采用的方法是：在处于对数生长晚期的含有Col1一类质粒的大肠杆菌培养物中，加入氯霉素或壮观霉素等蛋白质合成抑制剂，此时细菌染色体DNA的复制被阻断，而质粒DNA的复制不受什么影响，再继续培养10~12h后，每个细胞内的质粒拷贝数则可扩增到1000~3000个之多，这样就可以用较少量的大肠杆菌培养物获得大量的质粒DNA。 • ⑵ 低拷贝数的质粒载体 • 分子量相对高，拷贝数低。某些克隆的编码基因的产物过量而影响寄主细胞的正常代谢，在克隆这样的基因时需要用低拷贝数的质粒作为载体，使其表达水平置于严格控制之下。

19. 有些低拷贝数质粒可与高拷贝数质粒连接成双复制子质粒，从而提高其拷贝数。有些低拷贝数质粒可与高拷贝数质粒连接成双复制子质粒，从而提高其拷贝数。 • ⑶ 失控的质粒载体 • 有些质粒载体具有温度敏感复制控制特点，在不同的温度条件下其拷贝数有显著的变化。即低拷贝数的质粒在某些温度下其复制失去了控制而表现高拷贝数质粒的特点，虽然这会导致细胞的生长受到抑制，但此时质粒DNA的产量得到明显的提高。 • ⑷ 插入失活的质粒载体 • 大部分情况下要克隆的外源DNA片段都没有选择性标记，此时用我们以前讲过的标记基因内有限制位点的质粒载体来克隆这些外源DNA片段，使质粒的某一选择性标记失活而选择带有外源DNA片段的转化子。 • 也可用对载体酶切末端进行修饰等方法达到同样的目的。

20. ⑸ 正选择质粒载体 • 应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件下进行选择，这样我们在转化之后直接就能选择出重组质粒。

21. 举例：正选择质粒载体pKN80 • Pkn80编码一种对Mu噬菌体非溶源性菌株具有致死效应的kil基因，在pKN80质粒的HpaI或HindIII位点插入外源DNA，便会使这种致死效 应失活，产生出具 有Ampr表型的Mu 噬菌体非溶源性的 转化子菌株。这样， 我们就直接选择出 在HpaI或HindIII位 点插入外源DNA的 重组体质粒之转化 子。

22. 典型的大肠杆菌表达载体 • ⑹ 表达性的 质粒载体 • 将克隆外源真核基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下，这种特殊设计构建，能使克隆在其特定位点上的外源真核基因的编码序列在大肠杆菌细胞中正常转录并翻译成相应蛋白质的克隆载体称为表达载体。

23. 4.1.4 重要的大肠杆菌质粒载体 • 4.1.4.1 pSC101 • pSC101是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体。 • 平均每个寄主细胞仅有1~2份拷贝，分子量为9.09Kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr）。 • 该质粒具有EcoRI等7中限制性内切酶的单一切割位点，其中HindIII、BamHI和SalI等3个位点克隆外源DNA时，都会导致tetr基因的失活。

24. pSC101应用实例1： • 金黄色葡萄球菌的Ampr 基因插入pSC101 质粒

25. pSC101应用实例2： • 应用pSC101质粒作载体在大肠杆菌细胞中 • 克隆非洲爪蟾的rDNA基因片段

26. 4.1.4.2 pBR322 • pBR322 质粒由3个不同来源的部分组成：第一部分来源于pSF2124质粒易位与Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分来源于CoLEI的派生质粒pMB1的DNA复制起点。

27. pBR322 质粒的优点： • ⑴ 分子量较小：4363bp，易于自身DNA的纯化，可克隆达6kb的外源DNA。 • ⑵ 具有两种抗生素抗性基因（ampr和tetr）可供作转化子的选择性标记， • ⑶ 具有多达24种限制性内切酶的单一切割位点，其中， BamHI等9种限制性内切酶的切割位点在位于tetr基因的内部或启动子区域，另外在ampr基因内部还有PstI等3个限制性内切酶的切割位点，这些位点上克隆外源DNA时都会导致抗性基因的插入失活，从而为转化子的选择提供了很大的方便。

28. pBR322 质粒载体tetr基因的插入失活

29. 4.1.4.3 pUC 质粒载体 • pUC质粒载体是在pBR322的基础上，使用多克隆位点（MCS）技术，组入了一个在其5′-端带有一段MCS位点的lacZ′基因，从而发展成为具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 • ⑴ pUC质粒载体的结构：有以下4个组成部分 ① 来自pBR322的复制起点； ② 无限制位点的氨苄青霉素抗性基因（ ampr）； ③ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码 α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ′基因； ④ 位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段MCS位点（并不 破坏lacZ′基因的功能）

31. pUC18 及 pUC19 质粒载体的多克隆位点（MCS）

32. pUC 质粒载体的优点 • ① 分子量小拷贝数高，分子量只有2.7kb左右，而拷贝数未经 氯霉素扩增即可高达500~700个/细胞； • ② 适用于组织化学方法检测重组体。由于有lacZ′基因，所编码的α-肽链可参与α互补，因而可用X-gal显色的组织化学方法一步实现对重组体转化子克隆的鉴定。 • ③ 具有多克隆位点MCS区段，而且与M13mp8噬菌体的MCS 相同。因此在MCS上克隆的外源DNA片段可以方便地转移 到M13mp8载体上进行测序。同时，由于有不同限制位点， 还可以把具有不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到 pUC质粒载体上。

33. 4.1.4.4其它重要质粒载体 • （1）丧失迁移功能的质粒载体——pBR327 pBR327是从pBR322改建而来，比pBR322缺失了一条1.09kb的DNA片段，导致在复制和结合能力方面发生了改变，但氨苄青霉素抗性和四环素抗性的基因保持完整。 • pBR327有如下2个 主要特点： • ① 拥有较高的拷贝数， 平均每个大肠杆菌 寄主细胞可达30~ 45份； • ② 由于失去了bom位点， 不能提高结合而转移， 具有更高的安全系数。

34. （2）能在体外转录克隆基因的质粒载体——pGEM-3Z（2）能在体外转录克隆基因的质粒载体——pGEM-3Z • pGEM-3Z由pUC系列质粒载体派生而来，是与pUC系列十分类似的小分子质粒载体。有一个氨苄青霉素抗性基因和一个 lacZ′基因，后面插入了一段含有EcoRI等13个限制性内切酶识别位点的多克隆位点（MCS）。 • pGEM-3Z与pUC系列质粒载体的主要区别在于它具有2个来自噬菌体的启动子——T7启动子和SP6启动子，分别位于MCS位点两侧，取向相反。它们为T7或SP6的RNA聚合酶提供了特意性的识别位点。 • pGEM-3Z和 pGEM-3Z的差别在于T7启动子和SP6启动子的位置互换，取向相反。 • 这样的载体还有pSP64和Psp65质粒载体，也是由pUC系列质粒载体派生而来。这些载体都可以在体外转录体系中进行转录和翻译克隆的外源基因。

35. pGEM-3Z／ pGEM-3Z 质粒载体及 其克隆位点 序列图

36. pSP64和Psp65质粒载体：含有噬菌体SP6的启动子，pSP64和Psp65质粒载体：含有噬菌体SP6的启动子， 两者之间的差别在于MCS位点取向彼此相反

37. （3）穿梭质粒载体 所谓的穿梭质粒载体是指一类人工构建的，具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 • 以大肠杆菌细胞为寄主进行基因操作具有技术成熟、方便实用等很多优点，而在其它的原核生物或真核生物细胞中进行直接的基因操作总是有很多麻烦的问题有待解决。所以，构建能够穿梭于大肠杆菌与其它生物细胞之间的载体就能解决这些难题了。 • 常见的穿梭质粒载体有大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体等，应用这样的载体，可以很方便地在大肠杆菌细胞中进行重组DNA操作和增殖，然后在返回到枯草芽孢杆菌或酿酒酵母中进行研究。 • 现在也有大肠杆菌和动物细胞之间的穿梭质粒载体，如利用大肠杆菌和牛乳头瘤病毒构建的pBPV-BV1。成功克隆到人β-干扰素基因，并在多种动物细胞中得到表达。

38. 举例说明—大肠杆菌-酿酒 酵母穿梭质粒载体 • 含有两种分别来自大肠杆菌 和酿酒酵母的复制起点和选 择标记，另有一个多克隆位 点。 （a）转化Amps大肠杆菌细胞； （b）转化LEU－酿酒酵母细胞； （c）质粒在两种细胞之间穿梭； （d）涂布在含氨苄青霉素的平 板上选择Ampr大肠杆菌转 化子； （e）涂布在无亮氨酸的平板上 选择leu－酿酒酵母转化子。

39. 4.2 噬菌体载体和柯斯载体 • 4.2.1 λ 噬菌体载体 • λ 噬菌体是迄今为止研究得最为详尽的一种大肠杆菌噬菌体，它与大肠杆菌一样，是同现代分子生物学及分子遗传学的创立和发展过程密切相关的。 • λ 噬菌体的分子量为31×106dal，基因组DNA分子的长度为48.502kb，已经定位的λ 噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与噬菌体生命周期的活动——称之为λ 噬菌体的必要基因；另一部分基因可以被外源基因或DNA取代而并不影响噬菌体的生命功能——称之为非必要基因；在λ 噬菌体线性双链DNA分子的末端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补 的5′单链突出序列——称之为粘性末端。感染大肠杆菌后， λ 噬菌体会迅速以粘性末端之间的互补作用而形成双链环状DNA分子，这个由粘性末端结合形成的双链区称为cos位点。

42. 4.2.1.1 λ 噬菌体载体的 构建及其主要类型 • （1）构建λ 噬菌体载体 的基本原理 • 由于野生型λ 噬菌 体DNA序列中常用的限 制性内切酶位点过多， 所以，首先消去多余的 限制位点和切除非必要 区段。 λ 噬菌体DNA限 制位点示意图

43. （2）λ 噬菌体载体的主要类型 • A 插入型载体 具有外源DNA插入克隆位点，并有插入失活效应，克隆的DNA片段长度在10kb以内，广泛应用与cDNA或小片段DNA的克隆。根据其插入失活效应的特异性，可分为以下两种亚型： • 免疫功能失活的插入型载体：这类载体的免疫区内带有一两种限制性内切酶单切位点，当外源DNA片段插入后其免疫性遭受破坏，不能进入溶源周期而形成清晰的噬菌斑；而没有外源DNA插入的亲本噬菌体会形成浑浊的噬菌斑，为分离重组体分子提供了方便。 • β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：许多λ 噬菌体载体基因组中含有一段大肠杆菌的lac5区段，其中有lacZ基因，插入位点在lac5区段内，当外源DNA片段插入后，其β-半乳糖苷酶基因失活。用这种载体感染大肠杆菌lac－指示菌，涂布在含有IPTG和Xgal的培养基平板上，就会形成只能形成白色菌落。而由未插入外源DNA片段的载体感染大肠杆菌lac－指示菌，涂布在含有IPTG和Xgal的培养基平板上，就会形成蓝色菌落。

45. B 替换型载体 • 这种载体的中央部分有一个可以被外源DNA片段所取代的DNA片段，可取代部分两侧的多克隆位点是反向重复序列。当外源DNA片段插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。替换型载体可承受15kb外源DNA片段的有效克隆能力。

46. （3）Charen噬菌体载体 • Charen噬菌体（charen bacteriophage）载体是λ 噬菌体基础上发展出来的一种特殊的噬菌体载体。许多Charen噬菌体载体都带有 β-半乳糖苷酶基因以及它的操纵区和启动子的lac5取代片段，从而在感染大肠杆菌lac－指示菌后产生不同颜色的菌落而识别重组体或非重组体。 • Charen噬菌体载体中既有插入型载体，也有替换型载体。 • Charen噬菌体载体克隆外源DNA片段的一般程序 • 首先，分离线性载体DNA，限制酶切消化，分离片段取两臂；其次，将分离得到的两条载体臂段与经相同限制酶消化的外源DNA片段混合，加入连接酶连接；第三，将连接物与包装蛋白混合温育，使之包装成具有感染能力的噬菌体颗粒；最后把包装产物涂布在敏感细菌平面上进行组织化学检测。