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血流感染实验室诊断新进展

血流感染实验室诊断新进展. 北京协和医院检验科 王瑶 2013 年 4 月 13 日. 内容. 什么是血流感染？ 血流 感染流行病学特点 血培养流程优化 提高阳性率 分析培养结果 减少污染 分子生物学 方法检测血流感染 基于 PCR 的技术 MALDI-TOF MS PNA-FISH. 概念. 感染＝炎症 + 病原体 全身炎症反应综合征（ SIRS ） 体温 >38 ⁰C 或 <36 ⁰ C 心率 >90 次 / 分 呼吸频率 >20 次 / 分，或 PaCO 2 <32mmHg

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血流感染实验室诊断新进展

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Presentation Transcript

  1. 血流感染实验室诊断新进展 北京协和医院检验科 王瑶 2013年4月13日

  2. 内容 • 什么是血流感染？ • 血流感染流行病学特点 • 血培养流程优化 • 提高阳性率 • 分析培养结果 • 减少污染 • 分子生物学方法检测血流感染 • 基于PCR的技术 • MALDI-TOF MS • PNA-FISH

  3. 概念 • 感染＝炎症+病原体 • 全身炎症反应综合征（SIRS） • 体温>38⁰C或<36 ⁰C • 心率>90次/分 • 呼吸频率>20次/分，或PaCO2<32mmHg • 白细胞>12×109/L或<4×109/L，或幼稚细胞>10% • 脓毒血症（sepsis）＝感染+SIRS，血培养可以阳性或阴性 • 重度脓毒血症（severe sepsis）＝sepsis+脏器功能障碍、组织灌注不良和低血压 • 感染性休克（septic shock）

  4. 概念 • 败血症（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征，是一种严重的全身感染。病原菌主要是细菌，也可为真菌、分枝杆菌等。 • 菌血症（bacteremia）：细菌在血流中短暂出现的现象，一般无明显毒血症状，在国外文献中常与败血症通用。 • 血流感染（bloodstream infection, BSI）：败血症和菌血症目前统称为血流感染。

  5. 血流感染 • 医院获得性血流感染 • 原发血流感染 • 实验室证实血流感染（Laboratory-confirmed Bloodstream Infection, LCBI） • 临床血流感染（Clinical Sepsis） • 继发血流感染：血培养分离出有意义微生物，而且此微生物与另一部位之院内感染有关。唯不包括血管或血管内导管装置所引起之血流感染。 • 社区获得性血流感染

  6. 实验室证实血流感染（LCBI） • 标准一：从一次或多次血标本中培养出一种一致的致病菌，而且培养出的病原体与其它部位的感染无关。 • 标准二：病人至少具有下列症状和体征之一：发热（>38 ⁰C ），寒颤或低血压，并致病符合下列之一： • 1.从两次或两次以上不同部位抽血的标本中培养出皮肤寄生菌（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌）。 • 2.至少一次从带血管内导管的病人血标本中培养出皮肤寄生菌群（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌），并且主管医生开始了适当的抗菌药物治疗。 • 3.血中抗原检测阳性（如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌或B群链球菌）。与实验室阳性结果一致的症状和体征与其它部位的感染无关。 • 标准三：年龄<1岁的病人具备下列症状或体征中的至少一项，发热（>38 ⁰C ），低温（<37 ⁰C ），呼吸暂停、脉搏徐缓，并具有下列之一（同上3点略）

  7. 临床血流感染（Clinical Sepsis） 具有下列二条件之一者： • 具有非其它已知原因所引起的发烧、血压过低（收缩压≤90mmHg或收缩压低于平常超过40mmHg），少尿（每小时尿量低于30ml）等临床症状任何一项，且符合下列所有条件者： • 未做血培养，或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者 • 其它部位无明显感染者 • 医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗 • 1岁以下婴儿 ，具有非其它书籍原因引起的发烧、体温过低、呼吸中止或心跳过缓等临床症状任何一项，且符合下列所有条件者： • 未做血培养，或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者 • 其它部位无明显感染者 • 医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗

  8. BSI流行病学特点 • BSI发病率逐年增加 • 凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、真菌血流感染发病率逐年上升，革兰阴性菌下降 • 耐药菌比例逐年增加 • 社区获得与医院获得血流感染病原谱存在差异 • 院内BSI患者病死率高

  9. +600% +300% +300% 美国脓毒血症流行病学 Martin et al, NEJM 2003;348:1546

  10. 加拿大CANWORD监测2002-2009 DiagMicrobiolo Infect Dis. 2011; 69: 307

  11. 加拿大CANWORD监测2002-2009 Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 307

  12. 美国49医院BSI病原谱 CID. 2004, 39: 309-317

  13. PUMCH2012年834血培养分离株

  14. PUMCH2012年144株BSI大肠埃希菌药敏结果 ESBL 60.2%

  15. PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌药敏结果 ESBL 34.4%

  16. PUMCH2012年61株BSI鲍曼不动杆菌药敏结果

  17. PUMCH2012年76株BSI金黄色葡萄球菌药敏结果

  18. PUMCH2012年46株BSI草绿色溶血链球菌药敏结果

  19. 2011CHIF-NET489株BSI酵母菌

  20. 2011CHIF-NET念珠菌对氟康唑的敏感性

  21. 2011CHIF-NET念珠菌对伏立康唑的 敏感性

  22. 2011CHIF-NET其他酵母菌对氟康唑的敏感性

  23. 2011CHIF-NET其他酵母菌对伏立康唑的 敏感性

  24. 采血量是影响血培养阳性率的独立相关因素 • CLSI M47-A：每位患者采集2~3套血培养（40~60ml） • Surviving Sepsis Campaign Guidelines (Worldwide)：抗菌药物治疗前至少采集2套血培养 • 英国NHS血培养标准：采集2套血培养

  25. 采血量对血培养阳性率的影响 JCM 2007

  26. 采血量对血培养阳性率的影响 J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047

  27. 采血量和阳性率 非条件致病菌 Routine Set @ Mayo Clinic: 2 BACTEC Aerobic Plus Bottles + 1 BACTEC Anaerobic Lytic Bottle J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047

  28. 血培养污染菌 • 在多次血培养中单次培养下列细菌阳性 • 凝固酶阴性葡萄球菌 • 棒状杆菌 • 微球菌 • 丙酸杆菌 • 芽孢杆菌 • 如多次培养阳性，可能为条件致病菌，需结合临床分析

  29. 为什么需氧+厌氧？ 两种组合均能检测 非条件致病菌 Pathogen No. Mayo Clinic 不同的病原菌 (p<0.001) J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047

  30. 表皮葡萄球菌血培养阳性意义 CID 1997

  31. 血培养阳性时间－凝固酶阴性葡萄球菌 需氧瓶＝242 厌氧瓶＝72 需＋厌＝150 96%(+) 86%单瓶（＋）

  32. 血培养阳性时间－金黄色葡萄球菌

  33. 如何分析血培养凝固酶阴性葡萄球菌？ • University Hospital of Base，2003－2007 • 3060阳性血培养，654CNS，粒缺患者除外 • 232 (35%)真正BSI，422 (65%)污染 • BSI由感染科医生判断，至少一份血培养CNS阳性，有感染临床表现 • SIRS: 体温>38C or <36C; 心率>90/min; 呼吸 >20/min; 白细胞>12 or <4 G/L or >10% 未成熟中性粒细胞 • 32%患者有1瓶以上CNS阳性，BSI68 %，污染12%(p <0.001) • 没有SIRS症状：BSI 5%，污染29%(p <0.001) ClinMicrobiol Infect. 2012 online

  34. 单瓶血培养CNS的BSI和污染患者区别 Clin Microbiol Infect. 2012 online

  35. 单瓶血培养CNS阳性BSI与临床症状相关性 Clin Microbiol Infect. 2012 online

  36. Clin Microbiol Infect. 2012 online

  37. 降低血培养污染率－－严格消毒 • 血培养瓶消毒：70%酒精消毒血培养瓶橡皮塞,待干60秒。或70%异丙醇消毒干燥 • 皮肤消毒： • 三步法 • 70%酒精擦拭静脉穿刺点 >30秒 • 1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒：从穿刺点向外画圈消毒,直径>3cm • 70%酒精脱碘 • 一步法 • 葡萄糖酸洗必泰作用30 s，或70%异丙醇消毒后自然干燥，但不适用于2个月以内的新生儿。

  38. 急诊血培养污染率与工作量相关 • The University of Michigan Health System急诊 • 血培养大多数由采血员采集，其次为护士和医生 • 采血员:病人= 1:9，重症区护士:病人= 2:3，其它区域护士:病人=1:4 • 年病人量82521人，采集血培养者7586人 • 11.4%至少1瓶阳性，病原菌阳性率8.0%，污染率3.7% • 多套培养患者阳性率7.4%，单套培养阳性率5.1%（p<0.001），污染率无显著差别（2.2% vs. 2.6%） Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online

  39. 急诊小时工作量 Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online

  40. 繁忙时血培养污染率增加 OR=1.23 OR=0.93 Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online

  41. 抗菌药物治疗与血流感染死亡率 死亡率 Chest 115 (2): 1999

  42. 血培养三级报告制度 鉴定＋标准药敏 鉴定菌株 传种培养 革兰染色 血培养 阳性 终报告 电话报告 初步报告 (直接药敏)

  43. 血培养结果回报对治疗的影响 • A = Appropriate Therapy(正确治疗) • I = Inappropriate Therapy(不正确治疗) ClinInfec Dis 24:584-602, 1997

  44. 血流感染快速分子诊断 • 分子诊断不受抗菌药物使用的影响 • 血培养阳性后分子诊断 • 直接使用血标本进行分子诊断 • 快速 • 但不能提供药敏结果

  45. 血培养阳性瓶分子鉴定 Antigone Kotsaki, et al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209

  46. 阳性血培养－基于PCR的检测 • PCR特异性检测 • 病原特异性PCR • 特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA, 肠球菌van • 细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数 • 广谱检测：PCR扩增特定靶位 • 多态性分析 • 测序 • 后续基因检测 • 种特异性real-time PCR Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis. 2011, 24(2):137

  47. qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌 • Target：ecfX gene • 血培养系统：BacT/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均显示G-b • 对照方法：氧化酶，API 20E • DNA提取：0.5ml肉汤，离心后加裂解液，水煮法 • 定量PCR： • 扩增：Oligonucleotide primers • 基因特异性检测：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragment AnnalClinMicrobiolAntimicrob 2010, 9:21

  48. qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌 • 33瓶pae，敏感性和特异性均为100% • 1瓶kpn+pae，由于pae(20CFU/ml)≤kpn (108CFU/ml)，PCR(-) • 检测限：将ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21

  49. 阳性血培养－基于PCR的检测 • 最常见病原体多重PCR • 电泳谱、ELISA杂交、多重Real-time PCR • HyplexBloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成 • Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland)：多重real-time PCR+微阵列分析，检测多种病原及mecA，3h完成 • 多重Real-time PCR Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.

  50. 血培养阳性－多重real-time PCR NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013

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