Gli exosomi e il loro ruolo nei processI Cellulari

1. Gli exosomi e il loro ruolo nei processI Cellulari Candidato: Nikola Dino Capocchiano Relatrice: Dott.ssa Anna Rita Rossi

2. Vescicole Extracellulari Tre classi distinte: Ectosomi • Biogenesi: Gemmazione dalla membrana citoplasmatica • Dimensione: 50 – 1000nm Exosomi • Biogenesi: Rilascio tramite fusione di corpi multivescicolari con la membrana citoplasmatica (Da Raposo e Stoorvogel; 2013) • Dimensione: 40 – 100nm Corpi apoptotici • Dimensione: 500 – 2000nm (da Johnes et al., 2008)

3. Exosomi: Biogenesi • Formazione di vescicole • Gemmazione verso l’interno degli endosomi precoci • Maturazione degli endosomi in corpi multivescicolari • Rilascio degli exosomi tramite fusione dei corpi multivescicolari con la membrana cellulare (da Raposo e Stoorvogel, 2013)

4. Exosomi: Meccanismi di Biogenesi Meccanismo ESCRT-dipendente (EndosomalSortingComplexesRequiredforTransport) Meccanismi ESCRT-indipendenti Mediati da: Ceramidi – inducono curvatura nella membrana Tetraspanine – Selezione del contenuto vescicolare (da Raiborg e Stenmark, 2009) ESCRT-0 – Reclutamento del cargo, ubiquitina dipendente ESCRT-1 e ESCRT-2 - Inducono la gemmazione delle ILV ESCRT-3 - Scissione delle gemme dalla membrana Vps4 – Coinvolto nella rimozione del macchinario ESCRT Componenti principali:

5. Exosomi: Secrezione Fusione della membrana dei corpi multivescicolari con la membrana citoplasmatica • Proteine coinvolte • Integrine • Tetraspanine • SNARE GTPasi della famiglia Rab: Rab27a e Rab27b (da Johnstone, 2005)

6. Rab27a e Rab27b Cellule HeLa trasfettate con shRNA Livelli di espressione dell’mRNA di Rab27a e Rab27b in seguito al knockdown Risultato: Livelli di espressione risultano notevolmente diminuiti (da Ostrowski et al., 2010)

7. Rab27a e Rab27b Isolazione degli exosomi Analisi del peso dei pellet exosomiali Risultato: I pellet ricavati hanno un peso minore rispetto ai pellet usati come controllo. (da Ostrowski et al., 2010)

8. Rab27a e Rab27b Variazione delle proteine exosomiali? Western Blot per verificare l’espressione dei biomarcatori presenti sugli exosomi e nei lisati cellulari Risultato: Biomarcatori degli exosomi sono ancora tutti espressi. (da Ostrowski et al., 2010)

9. Rab27a e Rab27b Quantità di proteine ricavate da un campione totale di 20,000,000 cellule knockdown Exosomi purificati (da Ostrowski et al., 2010) (da Ostrowski et al., 2010)

10. Interazioni con le cellule bersaglio 1) Legame permanente o transitorio con la membrana citoplasmatica 2) Fusione con la membrana citoplasmatica 3) Internalizzazione tramite endocitosi 4) Formazione di nuovi exosomi (da Raposo e Stoorvogel, 2013)

11. Exosomi: Funzioni Biologiche • Modulazione della risposta immunitaria • Ruolo nello sviluppo di neoplasie • Propagazione virale • Presentazione diretta degli antigeni • Internalizzazione degli exosomi • Presentazione indiretta degli antigeni • Secrezione di nuovi exosomi (da Robbins et al., 2014)

12. Exosomi: Funzioni Biologiche Duplice ruolo nello sviluppo dei turmori • Modulazione della risposta immunitaria • Coadiuvazione della risposta anti-tumorale • Contribuzione alla propagazione delle neoplasie • Ruolo nello sviluppo di neoplasie • Propagazione virale (da Saleem et al., 2014)

13. Ruolo nello sviluppo di neoplasie - FasL • Proteina integrale di membrana di tipo II • Appartentente alla famiglia delle TNF • Induce apoptosi tramite il legame con CD95/APO Esperimenti di Ren et al. del 2010 Immagine al microscopio elettronico a trasmissione (da Ren et al., 2010)

14. Ruolo nello sviluppo di neoplasie - FasL Western Blot per confermare la presenza di biomarcatori degli exosomi Risultato: Confermata la presenza di FasL e altre proteine caratterizzanti gli exosomi (da Ren et al., 2010)

15. Ruolo nello sviluppo di neoplasie - FasL Densità ottica rievata in presenza di diverse concentrazioni di exosomi incubati con linfociti CD4+ Risultato: Crescenti concentrazioni di exosomi inducono apoptosi nei linfociti CD4+ (da Ren et al., 2010)

16. Ruolo nello sviluppo di neoplasie - FasL Anticorpi anti-FasL Anticorpi anti-CD63 Anticorpi Controllo Densità ottica rivelata dopo l’incubazione dei linfociti T CD4+ con diversi anticorpi a differenti concentrazioni di exosomi Risultato: Inibizione di FasL reprime l’effetto apoptotico del ligando (da Ren et al., 2010)

17. Exosomi: Funzioni Biologiche • Modulazione della risposta immunitaria • Sviluppo di neoplasie • Propagazione virale Propagazione di HIV tramite il pathway exosomiale (da Izquierdo-Useros et al., 2010)

18. Conclusioni • Exosomi sono importanti mediatori della comunicazione cellulare • Presentano molte molecole che fungono da biomarcatori • Importanti prospettive future, non solo nella ricerca di base (da Pant et al., 2012)

19. Ringraziamenti Dott.ssa Anna Rita Rossi