ROBBINO Matthieu

1. 2013 ROBBINO Matthieu

2. Xanthomas campestris pv. Campestris • - Gram négatif • - Gamma proteobacterie • Bactérie pathogène pour les plantes (pourriture noire)

3. Différents types de système de sécrétion Cours de Sophie Bleves

4. Le système de Sécrétion de Type II SST2 a été identifié en 1987 pour la première fois chez la bactérie Klebsiella . oxytoca (Enfert et al., 1987). -> Découverte de Tat dans la sécrétion de type II avec deux phospholipases Voulhoux et al., EMBO J, 2001

5. Le système de Sécrétion de Type II XpsD : Sécrétine XpsL : protéine de membrane interne XpsE: ATPase XpsG : Pseudopiline Johnson TL et al., FEMS Microbiol Lett (2006)

6. 2006

7. Le système de sécrétion de type II Douzi B et al.,J Biol Chem (2011) Chez Pseudomonas aeruginosa

8. But de l’article Observation de la dynamique de localisation de l’ATPase par rapport au système de sécrétion de type II Sandkvist et al., Microbio (2006)

9. Méthode • Réalisation d’une fusion de XpsE-ECFP (ATPase) et observation de sa localisation chez différents mutants • Analyse de la localisation de XpsE en surproduisant une exoprotéine (alpha-amylase). • Colocalisation de XpsE-ECFP avec le canal de sécrétion

10. Fusion XpsE-ECFP(ATPase) ECFP est un dérivé de la GFP et donne une fluorescence bleu cyan Alpha-amylase Enzyme hydrolysant les polysaccharide comme l’amidon par exemple. Première enzyme découverte en 1833 par Anselme Payen et Jean Francois Persoz

11. Test de la fusion XpsE ECFP plasmidique  Complémentation de la XpsE-ECFP donc celle ci est fonctionnellement intacte (sécrétion de l’apha-amylase) YL Chen et al., PloS One. 2013.

12. Test de la fusion XpsE-ECFP plasmidique Immunoblot anti GFP Immunoblot anti ATPase • Fusion plasmidique en abondance et stable chez le mutant xpsE- • Chez le mutant xps-, déstabilisation de la protéine YL Chen et al., PloS One. 2013.

13. Localisation de XpsE-ECFP(ATPase) chez des cellules compétentes ou non compétentes pour la sécrétion FM4-64: coloration se fixant à la membrane externe YL Chen et al., PloS One. 2013.

14. Conclusion intermédiaire Cellule non compétente (xps-) Cellule compétente En majorité dans le cytoplasme et quelques foyers périphériques chez les cellules compétentes Il y aurait un signal d’association à la membrane ce qui permettrait à XpsE de se lier à la membrane interne.

15. Observation des foyers périphériques et de l’intensité de la fluorescence de XpsE-ECFP en délétant la sécrétine Bitter, 2003 Complexe de sécrétines, le nombre de monomères (12 à 15 SU) présents dans le complexe final varient d’un système à l’autre Johnson TL et al., FEMS Microbiol Lett (2006)

16. Blocage de la sécrétion avec un mutant xpsD-  Augmentation de foyers périphériques chez des mutants XpsD- YL Chen et al., PloS One. 2013.

17. Contrôle de l’apparition focale avec intégration de XpsE-ECFP au niveau chromosomique Technique : Recombinaison en deux étapes

18. Contrôle de l’apparition focale avec intégration de XpsE-ECFP au niveau chromosomique => Diminution de l’intensité de fluorescence de XpsE-ECFP chromosomique mais avec la présence de foyers chez xpsD- YL Chen et al., PloS One. 2013.

19. Surproduction de l’alpha-amylase en introduisant pAmy  L’exoprotéine s’accumulent dans le périplasme chez xpsD- avec une augmentation de l’intensité de fluorescence et une augmentation de l’abondance de foyers YL Chen et al., PloS One. 2013.

20. Conclusion intermédiaire • De plus, l’augmentation de foyers périphériques est spécifique de l’accumulation d’exoprotéines périplasmiques xpsD+ xpsD-

21. XpsL Protéine de la membrane interne intéragissant avec XpsE au niveau de son domaine N-ter cytoplasmique Johnson TL et al., FEMS Microbiol Lett (2006)

22. Double mutant XpsD/XpsL  XpsL est nécessaire pour la formation de foyers périphériques YL Chen et al., PloS One. 2013.

23. Observation de la quantité de protéines XpsE,D,L  Avec pL2 on a une stabilisation de l’ATPase dans une souche avec le double mutant xpsD/xpsL YL Chen et al., PloS One. 2013.

24. Double mutant xpsE(KMRA)-ECFP chromosomique avec pAmy chez une souche xpsD- et xpsD+ Shiue SJ et al., 2006 xpsE(KMRA)–ECFP correspond à la double mutation xpsE (K331M, R504A)  Fluorescence diffuse chez un double mutant xpsE (KMRA)-ECFP YL Chen et al., PloS One. 2013.

25. Quantité de XpsE-ECFP dans les souches xpsD+ et xpsD-  Stabilisation de XpsE-ECFP chez xpsD+ et déstabilisation de la fusion chez xpsD- YL Chen et al., PloS One. 2013.

26. Conclusion intermédiaire • Lors de l’introduction de pL2 on a une augmentation de la quantité de protéine XpsE-ECFP => Stabilisation • Chez un mutant xpsE(KMRA), on a une plus forte quantité de protéine XpsE-ECFP chez une souche xpsD+ •  Les foyers XpsE-ECFP correspondraient à un recrutement fonctionnel de l’ATPase à la machinerie de sécrétion XpsE(KMRA) XpsL-,XpsD- XpsL-,XpsD- + pL2

27. Insertion de Myc-tag Insertion de Myc chez XpsD rend 4 protéines différentes : • XpsD MH64 est aussi fonctionnelle que le sauvage (module NO) • XpsD MH62 et MH54 sont partiellement fonctionnelles (module N3 et N1) • XpsD MA25 est non fonctionnelle (module sécrétine)

28. Compétence de la sécrétion en fonction de la quantité de foyers périphériques  Relation inversée entre l’activité de sécrétion et le nombre de foyers périphériques YL Chen et al., PloS One. 2013.

29. Restauration de la fonction normale du canal de sécrétion en réduisant progressivement l’abondance des foyers  Plus il y a une restauration de la compétence de sécrétion moins il y a de foyers YL Chen et al., PloS One. 2013.

30. Colocalisation des foyers XpsE-ECFP avec le canal de sécrétion  Colocalisation plus abondante chez souches partiellement fontionnelles (MH62) que chez des souches compétentes YL Chen et al., PloS One. 2013.

31. Conclusion générale • L’ATPase (XpsE) du système de sécrétion de type II travaille avec le reste de la machine de sécrétion, elle est dynamique et bien régulée dans le temps et l’espace • Le statut de l’exoprotéine influence l’association de l’ATPase à la machinerie • L’assemblage de l’ATPase au niveau de la membrane interne entraine une machinerie de sécrétion active

32. Modèle proposé YL Chen et al., PloS One. 2013.

33. Discussion Le recrutement de l’ATP pourrait être lié à l’oligomérisation de l’ATPase La réduction du niveau de l’exoprotéine dans le périplasme peut inciter la dissociation de XpsE avec la membrane.

35. L’ATPase a une fonction dans l’assemblage du pseudopilus ? L’ATPase active serait capable de conduire à l’assemblage du pseudopilus comme pour le pilus de type IV fournissant une force pour pousser l’exoprotéine vers l’extèrieur

36. Comparaison du système de sécrétion de Type II avec le pilus de Type IV  Seulement une seule ATPase a été identifée dans le SST2 mais dans le pilus de type IV il y a une ATPase pour l’assemblage et une pour le démontage

37. Perspective • Comment le niveau réduit de l’exoprotéine dans le périplasme est percue par l’ATPase ? • La fin de l’assemblage du pseudopilus peut être le signal de la fin de la sécrétion ? • Comment l’ATPase est recruté par la machinerie de sécrétion ?