1 / 75

Mikroorganismu gēnu inženierija

Mikroorganismu gēnu inženierija. 10 . Lekcija 20 13 ./20 14 . mācību gada 2. semestris. Apgrieztā transkripcija. Pie poli(A) RNS tiek piesaistīts (dT) oligonukleotīda praimeris Revertāze veic pirmā DNS pavediena sintēzi par matricu izmantojot RNS

taylor
Télécharger la présentation

Mikroorganismu gēnu inženierija

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Mikroorganismu gēnu inženierija 10. Lekcija 2013./2014. mācību gada 2. semestris Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  2. Apgrieztā transkripcija • Pie poli(A) RNS tiek piesaistīts (dT) oligonukleotīda praimeris • Revertāze veic pirmā DNS pavediena sintēzi par matricu izmantojot RNS • Revertāzei sasniedzot mRNS 5’ galu, tā izveido cilpu un turpina DNS sintēzi par matricu izmantojot pirmo DNS pavedienu (aptuveni 10 - 20 nt) • Revertāze hidrolizē RNS matricu • DNS polimerāze sintezē otro pavedienu par praimeri izmantojot revertāzes izveidoto cilpu • DNS cilpa tiek šķelta ar nukleāzi S1 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  3. DNS atkarīgās DNS polimerāzes Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  4. cDNS Otrā DNS pavediena sintēzi var veikt izmantojot jebkuru DNS polimerāzi. Bieži lieto DNS polimerāzi I vai Klenova fragmentu. EC 2.7.7.7 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  5. DNS atkarīgās DNS polimerāzes Lielākai daļai DNS polimerāžu piemīt ne tikai polimerāzes aktivitāte, bet arī eksonukleāzes aktivitātes. 5’=>3’ eksonukleāze 3’=>5’ eksonukleāze Eksonukleāzes aktivitātes atkarībā no polimerāzes pielietojuma var būt gan noderīgas, gan traucējošas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  6. DNS atkarīgās DNS polimerāzes E. coli DNS polimerāze I No viena polipeptīda sastāvošs enzīms ar molekulmasu 109 kDa. E. coli DNA Pol I piedalās DNS reparācijā un arī replikācijā (bet nav galvenais DNS replikācijas enzīms). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  7. DNS atkarīgās DNS polimerāzes DNS Pol I piemīt visas 3 aktivitātes: - DNS polimerāzes; - 5’=>3’ ekzonukleāzes; - 3’=>5’ ekzonukleāzes (“proofreading” aktivitāte). 5`-TGCATGCA-3` GGCATGCA 3`-ACGTACGTACGTACGTACGTACGT-5` matrica Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  8. DNS atkarīgās DNS polimerāzes E. coli DNS polimerāzes I izmantošana GI • Sākotnēji izmantoja DNS polimerāzes aktivitāti, piemēram, lai sintezētu komplementārās DNS otro pavedienu. • Izmanto DNS iezīmēšanai ar nik-translācijas (nick-translation) metodi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  9. DNS atkarīgās DNS polimerāzes Klenova fragments Iegūst 1974. gadā šķeļot DNS Pol I ar proteāzi subtilizīnu no Bacillus subtilis 5’=>3’ ekzonukleāzes aktivitāti nosakošais proteīna domēns atrodas N-galā un to iespējams atdalīt, saglabājot tikai C-daļu ar polimerāzes un 3’=>5’ ekzonukleāzes aktivitāti Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  10. DNS atkarīgās DNS polimerāzes Klenova fragments Patlaban Klenova fragmentu iegūst ekspresējot E. coli klonētu DNS Pol I gēnu, kas kodē atbilstošo proteīna daļu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  11. DNS atkarīgās DNS polimerāzes Klenova fragmenta izmantošana: • DNS fragmentu galu 5’ pārkaru aizpildīšana • DNS fragmentu galu iezīmēšana, izmantojot [a-32P]dNTP Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  12. DNS atkarīgās DNS polimerāzes Klenova fragmenta izmantošana: • DNS nukleotīdu secības noteikšanai (sekvenēšanai) pēc Sangera didezoksiterminatoru metodes; • 3’=>5’ ekzonukleāzes aktivitāti var izmantot, lai “strupinātu” DNS fragmentu 3’ pārkares, kuras veidojas pēc DNS šķelšanas ar dažām restriktāzēm; Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  13. DNS atkarīgās DNS polimerāzes Klenova fragmenta izmantošana: • iezīmētu DNS fragmentu sintēzei ar nejaušo praimeru metodi (random priming); • dažādiem mērķiem - otrā DNS pavediena sintēzei par matricu izmantojot vienpavediena DNS u.c. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  14. 5`-TGCATGCATN 3`-ACGTACGTA-5` DNS atkarīgās DNS polimerāzes Klenova fragments exo- Saglabāta tikai polimerāzes aktivitāte, bet trūkst abas ekzonukleāžu aktivitātes. Neder DNS fragmentu galu 5’ pārkaru aizpildīšanai, jo nespecifiski pievieno 1 nukleotīdu 3’ galā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  15. DNS atkarīgās DNS polimerāzes Klenova fragments exo- Piemērots - DNS fragmentu iezīmēšanai, - DNS sekvenēšanai, - komplementārās DNS (cDNS) otrā pavediena sintēzei. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  16. DNS atkarīgās DNS polimerāzes T4 DNS polimerāze Tai ir: - DNS polimerāzes un - 3’=>5’ ekzonukleāzekāes aktivitāte. Eksonukleāzes aktivitāte ievērojami spēcīgāka kā Klenova fragmentam Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  17. DNS atkarīgās DNS polimerāzes T4 DNS polimerāze Izmanto DNS fragmentu 3’ pārkaru strupināšanai DNS fragmentu 5’ pārkaru aizpildīšanai (līdzīgi kā Klenova fragmentu) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  18. DNS atkarīgās DNS polimerāzes T4 DNS polimerāze Izmanto DNS fragmentu 3’ galu iezīmēšanai ar aizvietošanas reakciju Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  19. DNS atkarīgās DNS polimerāzes T7 DNS polimerāze un sekvenāze Piemīt tādas pat aktivitātes kā T4 DNS polimerāzei, bet tā ir aktīvāka (ātrdarbīgāka). Ar T7 polimerāzes modifikāciju izveidots DNS sekvenēšanai piemērots enzīms sekvenāze. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  20. DNS atkarīgās DNS polimerāzes Sekvenāze Ķīmiski vai ģenētiski modificējot izveidoti divi enzīmi: - sekvenāze I un - sekvenāze II. Tiem nepiemīt eksonukleāzes aktivitāte un - tie labāk izmanto nukleotīdu analogus (modificētus nukleozīdtrifosfātus). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  21. Apgrieztā transkripcija • Pie poli(A) RNS tiek piesaistīts (dT) oligonukleotīda praimeris • Revertāze veic pirmā DNS pavediena sintēzi par matricu izmantojot RNS • Revertāzei sasniedzot mRNS 5’ galu, tā izveido cilpu un turpina DNS sintēzi par matricu izmantojot pirmo DNS pavedienu (aptuveni 10 - 20 nt) • Revertāze hidrolizē RNS matricu • DNS polimerāze sintezē otro pavedienu par praimeri izmantojot revertāzes izveidoto cilpu • DNS cilpa tiek šķelta ar nukleāzi S1 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  22. Apgrieztā transkripcija Pēc vienpavediena DNS cilpas šķelšanas ar nukleāzi S1, izveidojas DNS fragments ar strupiem galiem - 3’ hidroksil, - un 5’ fosfātgrupām, kuru iespējams klonēt tieši vai pēc “linkeru” pievienošanas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  23. Vp NS šķeļošas endonukleāzes S1 nukleāze no Aspergillus oryzae Šķeļ vienpavediena DNS un RNS, atstājot 5’ fosfātgrupu. Aktivitātei nepieciešami Zn2+ joni un pH=4,5 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  24. Vp NS šķeļošas endonukleāzes S1 nukleāze (Nuclease S1) EC 3.1.30.1 Hidrolizē tikai vienpavediena nukleīnskābes. EC 3.1.30. ... Endo-nukleāzes, kas šķēļ gan RNS gan DNS, veidojot 5`-fosfomonoesterus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  25. Vp NS šķeļošas endonukleāzes S1 nukleāze Pielieto: DNS molekulu vienpavedienu pārkaru nošķelšanai (DNS “galu strupināšana”); komplementārās DNS sintēzē - vienpavediena matadatas struktūras šķelšanai; NS struktūras pētījumos. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  26. Vp NS šķeļošas endonukleāzes “Mung-bean” nukleāze (MBN)no (Vigna radiata; Phaseolus aureus) zaļās sojas EC 3.1.30.(1) Līdzīgi kā S1 šķeļ vienpavediena RNS un DNS, mazāk bojā divpavediena nukleīnskābes, enzīms jūtīgs pret palielinātām sāļu koncentrācijām. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  27. Vp NS šķeļošas endonukleāzes “Mung-bean” nukleāze. Pielieto: • DNS molekulu vienpavedienu pārkaru “strupināšanai”; • DNS - proteīnu mijiedarbības pētījumiem; • komplementārās DNS sintēzē - vienpavediena matadatas struktūras šķelšanai. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  28. Apgrieztā transkripcija Otrā DNS pavediena sintēzei un iegūtās DNS pavairošanai izmanto arī - termostabilu DNS polimerāzi, - specifiskus praimerus, (PCR) Tad iespējams amplificēt noteikta veida kDNS . Praimeru izvēlei nepieciešama informācija par nukleotīdu secībām mRNS 5’ un 3’ galos. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  29. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  30. DNS iegūšana - alternatīvas Papildus genomiskās DNS un kDNS iegūšanai pastāv citas, alternatīvas iespējas iegūt klonējamus DNS fragmentus. Genomiskā DNS un kDNS izmantojama bibliotēku veidošanai, kurās pēc tam var meklēt noteiktu gēnu. Var iztikt bez bibliotēku veidošanas, ja ir informācija par interesējošā gēna nukleotīdu secību vai kodētā proteīna aminoskābju secību. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  31. DNS iegūšana - alternatīvas 1 Ja informācija par nepieciešamā DNS fragmenta secību ir bagātīga vajadzīgo fragmentu var pavairot ar PCR palīdzību un klonēt PCR fragmentu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  32. DNS iegūšana - alternatīvas 2 Ja informācija par nepieciešamā DNS fragmenta secību ir trūcīgāka (iespējams izveidot tikai vienu oligonukleotīdu), var veikt genomiskās DNS šķelšanu ar restriktāzēm, ar hibridizācijas palīdzību noteikt, cik liels fragments ietver vajadzīgo secību, un klonēt tikai tāda garuma fragmentus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  33. PCR Izmantojot PCR metodi, var amplificēt tieši interesējošo gēnu un iegūt pietiekami daudz DNS klonēšanai. Nepieciešams zināt nukleotīdu secības amplificējamā posma 5’ un 3’ galos. PCR izmanto, lai veidotu: - ekspresējošas sistēmas, - himērus gēnus, - atdalītu PCR produktu alēliskos maisījumus, - specifisku punktveida mutāciju ieguvei u.c. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  34. PCR Genomiskā DNS (1 mg DNS veido 3x105 cilvēka haploidāla genoma kopijas No 1 pg DNS iegūst 1 mg amplificētā fragmenta (3x1011 kopijas) PCR amplifikācija (20 cikli), izmantojot gēnam specifiskus praimerus Amplificētais fragments tiek sagatavots klonēšanai vektorā Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  35. Termostabilās DNS polimerāzes DNS atkarīgās DNS polimerāzes, katalizē DNS pavedienu sintēzi paaugstinātā temperatūrā, (termofīlo un hipertermofīlo organismu DNS polimerāzes) Termostabilo DNS polimerāžu pielietojums strauji attīstās pēc PCR metodes izstrādes (1983. - 1984. gadi, Cetus Corp., ASV, K.B. Mullis) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  36. Termostabilās DNS polimerāzes Par PCR metodi 1993. Gadā saņem Nobela prēmiju ķīmijā. Saiki et al. (1985). Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230, 1350-1354. Kary Mullis Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  37. Termostabilās DNS polimerāzes Vēsturiski pirmā termostabilā DNS polimerāze tika iegūta no eibaktērijas Thermus aquaticus 70-to gadu beigās. Šī baktērija tika atrasta jau 1966. gadā - Jelovstonas nacionālā parka karstajos avotos. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  38. Termostabilās DNS polimerāzes T. aquaticus optimālā augšanas temperatūra ir 70 - 72o C, bet maksimālā ~80o C. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  39. Termostabilās DNS polimerāzes No Thermus aquaticus iegūst Taq polimerāzi. Pēdējā laikā tās ieguvei izmanto arī ĢM E. coli līnijas. EC 2.7.7.7 Taq polimerāzei piemīt: - 5’=>3’ polimerāzes aktivitāte, - neliela 5’=>3’ ekzonukleāzes aktivitāte, - nav 3’=>5’ ekzonukleāzes (proofreading) aktivitātes. Vidēji 1 kļūda uz 3 500 sintezētiem nukleotīdiem. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  40. Termostabilās DNS polimerāzes Taq Pol Izmanto: - DNS fragmentu amplificēšanai, - DNS fragmentu iezīmēšanai, - sekvenēšanai. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  41. Termostabilās DNS polimerāzes Taq polimerāze amplificētajiem DNS fragmentiem 3’ galā nespecifiski pievieno A nukleotīdu. Klonējot PCR produktus, kas amplificēti ar Taq polimerāzi, tiem: - jāstrupina gali, - jālieto PCR praimeri ar restrikcijas saitiem, -jāizmanto speciāli vektori ar vienpavediena T pārkarēm 3’ galos. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  42. Termostabilās DNS polimerāzes Vent polimerāze no Thermococcus litoralis (arhebaktērijas), kas dzīvo dziļūdens vulkānu atveru tuvumā. Temperatūras optimums ir 72 - 80o C, bet maksimums ir ~98o C. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  43. Termostabilās DNS polimerāzes Vent polimerāze Piemīt: - 3’=>5’ ekzonukleāzes (proofreading) aktivitāte, kas nodrošina mazāku kļūdu skaitu (1 kļūda no ~20 000 nt.) Paaugstināta termostabilitāte un precizitāte, salīdzinot ar Taq Pol Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  44. Termostabilās DNS polimerāzes Pfu polimerāze no Pyrococcus furiosus (arhebaktērija) Temperatūras optimums ~75o C, maksimums >98o C; piemīt arī 3’=>5’ ekzonukleāzes aktivitāte. Pfu polimerāze pieļauj vismazāk kļūdu DNS sintēzē (1 kļūda no ~ 40 000 nt.) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  45. Termostabilās DNS polimerāzes Pfu polimerāze piemērota precīzai DNS fragmentu amplifikācijai. Tā ir stabilāka par Taq polimerāzi. Amplifikācijā sintezē DNS fragmentus ar strupiem galiem, kas derīgi tūlītējai klonēšanai. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  46. PCR produktu apstrāde Lai atvieglotu PCR iegūto DNS fragmentu klonēšanu, un novērstu Taq polimerāzes pievienoto 3` gala A pārkaru radītās problēmas, bieži lieto praimerus ar 5` gala pagarinājumiem, kuros izveidots kāds rets restrikcijas saits. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  47. PstI 5`- TGCCTGCAGGCATGCATGCATGCATGC 3`-TACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGT.. PCR produktu apstrāde Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  48. PstI 5`- TGCCTGCAGGCATGCATGCATGCATGCATGCA.. 3`- ACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTACGT.. PCR produktu apstrāde Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  49. Enzīms n %2h %20h BamHI1 10 25 2 >90 >90 HindIII2 0 0 3 10 75 5`- TGCNNNNNNGCATGCATGCATGCATGC PCR produktu apstrāde Restriktāzes aktivitātes atkarība no 5` gala pagarinājuma. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

  50. PCR produktu apstrāde Enzīms n %2h %20h EcoRI 1 >90 >90 NotI2 0 0 4 10 10 6 10 10 8 25 90 10 25 >90 Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra M.L.

More Related