Anomalies des gènes et leur exploration Alain Hovnanian Service de Génétique Médicale

1. Anomalies des gènes et leur exploration Alain Hovnanian Service de Génétique Médicale Hôpital Purpan Tél: 05 61 77 90 79 05 62 74 45 00

2. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

3. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

4. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

5. MUTATIONS Définition: Modification du matériel génétique (maladie/polymorphisme). Variation de séquence héréditaire ou acquise Origines: - Spontanées (endogènes) (1): - Anomalies de la réplication de l ’ADN - les plus fréquentes (10-6 paires de bases par génération) - erreurs de l’ADN polymérase (erreur de lecture conduisant à des mésappariements ou mismatch) - favorisées par les séquences répétées - Accidents de recombinaison méiotique - surviennent lors de la méiose - favorisés par des séquences d ’homologie entre chromosomes - délétions, duplications, recombinaisons illégitimes

6. Origines des mutations (suite): - Spontanées (2): - Déamination, en particulier de cytosine méthylée - très fréquent en pathologie humaine - non reconnu par les systèmes de réparation de l ’ADN - ex: Arg CGA -> Stop TGA - Dépurination - Espèces oxygène réactives (ion O2- superoxide, radicaux libres) - Provoquées (extérieurs): - agents génotoxiques - 3 types: . chimiques (hydrocarbones, chimiothérapie), . physiques (radioactivité naturelle et autres rayons ionisants, UV) . biologiques (virus) - normalement corrigés au cours de la réplication par les systèmes de réparation de l ’ADN - déficients dans certaines maladies génétiques (ex: xéroderma pigmentosum…)(cancers)

8. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

9. Types de mutations A - Mutations ponctuelles B - Insertions ou délétions de plusieurs bases C - Expansions de triplets (mutations instables) D - Macrolésions

10. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

11. A - Mutations ponctuelles Les plus fréquentes, extra ou intra-géniques, polymorphismes (RFLP, SNPs) ou mutations responsables de maladies génétiques 1 - Substitutions de base Définition: remplacement d ’un nucléotide par un autre Leur effet dépend de leur nature et position dans le gène: - régions codantes: - mutation silencieuse - mutation faux-sens -changement d ’un acide aminé par un autre - conservatrice (acide aminé de même classe) ou non conservatrice - mutation non-sens - changement d ’un acide aminé en un codon stop prématuré (TAA, TGA, TAG)

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13. 1 - Substitutions de base (suite) - régions codantes: cas particuliers: - codon d ’initiation de la traduction - codon de terminaison de la traduction - séquences « Exonic splicing enhancer  » (-> anomalie d ’épissage) - mutation non-sens entraînant le saut de l ’exon correspondant (-> rétablissement de la phase)

14. 1 - Substitutions de base (suite) - régions non codantes: - introns: - sites consensus d ’épissage (site donneur gt, site accepteur ag) - sites non consensus d ’épissage - site de branchement - conséquences: -> saut d ’exon -> rétention d ’intron -> activation d ’un site cryptique d ’épissage, exonique ou intronique - séquences régulatrices en amont du gène -> anomalies de régulation de la transcription - séquences 3 ’UTR -> instabilité de l ’ARNm

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18. gt ag ag gt gt c Saut d ’exon gt gt ag ag gt gt a Activation d ’un site cryptique d ’épissage gt ag ag gt gt stop Saut d ’exon Exemples anomalies d ’épissage

19. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

20. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

21. Conséquences possibles des mutations de la région 3’UTR Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

22. 2 - Délétion ou insertion d ’une base - régions codantes: entraînent un décalage du cadre de lecture (« mutations décalantes ») conduisant le plus souvent à un codon stop prématuré - régions non codantes: selon leur localisation: - région promotrice; anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage - région 3 ’ UTR: instabilité ARNm

23. B - Insertion ou délétions de plusieurs bases (micro-délétions ou micro-insertions) Perte ou ajout de plusieurs bases - régions codantes: - Si multiple de 3: perte ou ajout d ’un ou plusieurs acides aminés - Si non multiple de 3 entraînent un décalage du cadre de lecture conduisant le plus souvent à un codon stop prématuré - régions non codantes: selon leur localisation: - région promotrice: anomalie transcription - sites d ’épissage: anomalie d ’épissage - région 3 ’ UTR: instabilité ARNm

24. Délétions génomiques de COL7A1 dans l’EBD dominante 6081del28 6847del27

25. Conséquences des mutations Mutation respectant le cadre de lecture: - ex: . mutation faux-sens, insertion ou délétion multiple de 3, . anomalie d ’épissage respectant ou rétablissant la phase - conduisent à la synthèse d ’une protéine anormale présentant: - le remplacement d ’un acide aminé par un autre - la perte ou le gain d ’un ou plusieurs acides aminés -> protéine produite, mais stabilité et/ou fonction compromises

26. Conséquences des mutations (suite) Mutation interrompant le cadre de lecture: - ex: mutations non-sens, insertion ou délétion non multiples de 3 - conduisent à un codon stop prématuré pouvant entraîner: - instabilité de l ’ARNm muté (NMRD) - synthèse d ’une protéine tronquée ayant une extrémité COOH anormale - synthèse d ’une protéine amputée d ’une séquence peptidique (saut d ’exon portant un PTC) -> protéine non produite, ou instable et/ou non fonctionnelle

27. C - Expansions de triplets (mutations instables) - Répétitions instables de triplets nucléotidiques - Nature, nombre, localisation (région codante/non codante) variables - Souvent maladies neuro-dégénératives - Le plus souvent transmission autosomique dominante - Exemples Syndrome de l ’X fragile CGG 5 ’UTR XR Xq27 Dystrophie myotonique de Steinert CTG 3 ’UTR AD 19q13 Chorée de Huntington CAG codante AD 4p16 Ataxie de Friedreich GAA intron 1 AR 9q13

28. Mutations dynamiques (expansion de triplets) Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

29. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

30. D - Macrolésions - Conséquences délétères en pathologie et au cours de l ’évolution - Délétions de quelques centaines à plusieurs milliers de pb - Duplications - Fusion de gènes suite à une double cassure de l ’ADN (ex. translocation) - Inversions de gènes (orientation tête-bêche d ’un fragment d ’ADN)

31. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

32. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

33. Stratégies de recherche d ’anomalie des gènes (Maladie et gène connus +++) Analyse directe Mutation connue de petite taille de grande taille PCR - Enzyme de restriction - Hybridation spécifique d ’allèles - Séquençage +++ - Longue PCR ou - Southern-blot

34. Identification d ’une mutation non sens de COL7A1 par séquençage Père Arg->Stop CGA -> TGA Mère Arg->Stop CGA -> TGA EB Tropho

35. Analyse directe (1) Mutation inconnue PCR Détection: - SSCP Single strand conformational polymorphism - DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis - CSGE Conformation sensitive gel electrophoresis - DHPLC: Denaturing High Performance Liquid Chromatography Identification: - Séquençage +++

36. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

37. Technique du SSCP Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

38. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

39. Principe des techniques du DGGE, CSGE et DHPLC Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

40. Technique du DGGE Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

41. Technique du DGGE Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

42. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

43. Pic d ’élution anormal Détection de mutation de COL7A1 par DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)

44. PCR multiplex Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

45. Analyse directe (2) Macrolésions Cytogénétique Biologie moléculaire - Hybridation sur chromosome (FISH, Fluorescent in situ hybridization) - Southern-blot - PCR: Perte d ’hétérozygotie Défaut d ’amplification de l ’ADN

49. Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005

50. Technique du Southern blot Ameziane, Bogard et Lamoril. Elsevier 2005