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第 11 章 吸光光度法

11.1 吸光光度法基本原理 11.2 吸光光度法的仪器 11.3 显色反应及影响因素 11.4 吸光度的测量及误差控制 11.5 吸光光度分析方法 11.6 吸光光度法的应用. 第 11 章 吸光光度法. 11.1 吸光光度法基本原理. 光 : 一种电磁波 , 波粒二象性;. 1 单色光和复合光. 普朗克方程:  E=h u =hc/ l. 单色光 : 具有相同波长的光;. 复合光 : 由不同波长的单色光 组成的光;. 2 互补色. 3 物质对光的选择性吸收. 当光子的能量与分子的  E 匹配时,就会吸收光子。.

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第 11 章 吸光光度法

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  1. 11.1 吸光光度法基本原理 11.2 吸光光度法的仪器 11.3 显色反应及影响因素 11.4 吸光度的测量及误差控制 11.5 吸光光度分析方法 11.6 吸光光度法的应用 第11章 吸光光度法

  2. 11.1 吸光光度法基本原理 光:一种电磁波,波粒二象性; 1单色光和复合光 普朗克方程: E=hu=hc/l 单色光:具有相同波长的光; 复合光:由不同波长的单色光 组成的光;

  3. 2 互补色

  4. 3 物质对光的选择性吸收 当光子的能量与分子的E 匹配时,就会吸收光子。

  5. 吸收光谱曲线:物质在不同波长下吸收光的强度大小;A~l关系吸收光谱曲线:物质在不同波长下吸收光的强度大小;A~l关系 最大吸收波长 lmax:吸光度最大值处对应的波长。 吸收曲线的形状和lmax的位置取决于物质的分子结构。据此可进行定性分析。

  6. It I0 Ir Ia 4 朗伯-比尔定律 朗伯定律(1760年):光吸收与溶液层厚度成正比; I0 = Ir + It + Ia I0 = It + Ia T = It / I0 , T: 透射比或透光度 A=lg (I0 / It )=lg(1/T), A:吸光度 比尔定律(1852年):光吸收与溶液浓度成正比;

  7. 当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时,溶液的吸光度与溶液的浓度及光程(溶液的厚度)成正比关系---朗伯比尔定律当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时,溶液的吸光度与溶液的浓度及光程(溶液的厚度)成正比关系---朗伯比尔定律 ---光吸收定律 数学表达:A=lg(1/T)=Kbc 其中,A:吸光度,T:透射比, K:比例常数,b:溶液厚度,c:溶液浓度 注意: 平行单色光 均相介质 无反射、散射或光化学反应

  8. 灵敏度表示方法:摩尔吸光系数 c: mol/L A = ebc 摩尔吸光系数 ε A = Kbc c: g/L A = abc a: 吸光系数 e表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时,吸光物质对某波长光的吸光度。单位(L•mol-1 •cm-1)

  9. 桑德尔(Sandell)灵敏度: S 当仪器检测吸光度为0.001时,单位截面积光程内所能检测到的吸光物质的最低含量。 单位:mg/cm2 S=M/e

  10. 50ml容量瓶中有Nb30μg,用2cm比色池,在650nm测定光吸收,A=0.43,求S. (Nb原子量92.91)。 =3.3×104 L·mol-1·cm-1

  11. 在某一波长,溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质,那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和。在某一波长,溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质,那么溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和。 5、吸光度的加和性 A1 = e1bc1 A2 = e2bc2 A= e1bc1+ e2bc2 根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定。

  12. 读出系统 光源 单色器 样品池 检测器 11.2 吸光光度法的仪器 1 分光光度计的组成

  13. 常用光源

  14. 单色器 作用:产生单色光 常用的单色器:棱镜和光栅 样品池(比色皿) 厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质:玻璃比色皿--可见光区 石英比色皿--可见、紫外光区

  15. 检测器 作用:接收透射光,并将光信号转化为电信号。 常用检测器: 光电管 光电倍增管 光二极管阵列 光电管分为红敏和紫敏,阴极表面涂银和氧化铯为红敏,适用625-1000nm波长;阴极表面涂锑和铯为紫敏,适用200-625nm波长。

  16. 目视比色法—比色管 光电比色法—光电比色计 光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计 分光光度法与分光光度计 722型分光光度计光学系统图 1.光源;2.滤光片;3,8聚光镜4,7.狭缝;5.准直镜;6.光栅 9.比色池;10.光电管

  17. 分光光度计的类型: 根据波长范围:可见分光光度计、紫外-可见分光光度计和红外分光光度计; 根据仪器的结构与功能:单光束、双光束和双波长三种基本类型;

  18. 11.3 显色反应及影响因素 1 显色反应 没有颜色的或颜色较浅的化合物,需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定-- 显色反应; 要求: a. 选择性好 b. 灵敏度高 (ε>104) c. 产物的化学组成稳定 d. 化学性质稳定 e. 反应物和产物有明显的颜色差别 (l>60nm) 对比度(Δλ):络合物最大吸收波长(λMRmax)与试剂最大 吸收波(λRmax)之差。

  19. 2 显色反应类型 络合反应 氧化还原反应

  20. 3 显色剂 无机显色剂: 过氧化氢,硫氰酸铵,碘化钾 有机显色剂: 生色团:含有π→π*跃迁的不饱和基团 助色团:含非键电子的杂原子基团,如-NH2, -OH, -CH3… 偶氮类:偶氮胂III

  21. 三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料 铬天菁S 三苯甲烷碱性染料 结晶紫

  22. 形式 pH λmax(nm) 形式 pH λmax(nm) H4L+ 1.2 462-465 Sn4+ 1.0 530 H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+ 5.0 550 H2L- 8.4-9.0 512 HL2- 11.4-12.0 532-538 4 影响因素 • a 溶液酸度(pH值及缓冲溶液) 影响显色剂的平衡浓度及颜色,改变Δl 影响待测离子的存在状态,防止沉淀; 影响络合物组成 pH对苯芴酮及其络合物的颜色影响

  23. b 显色剂的用量 c 显色反应时间 针对不同显色反应确定显示时间 显色反应快且稳定;显色反应快但不稳定; 显色反应慢,稳定需时间;显色反应慢但不稳定 d 显色反应温度 加热可加快反应速度,导致显色剂或产物分解

  24. e 溶剂 有机溶剂,提高灵敏度、显色反应速率 f 干扰离子 消除办法: 控制酸度,加入掩蔽剂,改变价态 选择合适参比 褪色空白(铬天菁S测Al,氟化铵褪色,消除锆、镍、钴干扰) 选择适当波长

  25. 11.4吸光度的测量及误差控制 1、吸光度的测量条件的选择 1) 测定波长选择 选择原则:“吸收最大,干扰最小” 灵敏度 选择性 2) 测定浓度控制 控制浓度 吸光度A:0.2~0.8 减少测量误差

  26. 3) 参比溶液选择 仪器调零 消除吸收池壁和溶液对入射光的反射 扣除干扰 蒸馏水空白 试剂空白

  27. 4) 标准曲线制作 理论基础:朗伯-比尔定律 相同条件下 测定不同浓度标准溶液的吸光度A A~c 作图

  28. 光度分析法设计的步骤: 1. 选择显色反应 2. 选择显色剂 3. 优化显色反应条件 4. 选择检测波长 5. 选择合适的浓度 6. 选择参比溶液 7. 建立标准曲线 测量条件选择

  29. 2、 吸光光度法的误差 对朗伯-比尔定律的偏移: 非单色光引起的偏移 物理化学因素:非均匀介质及化学反应 吸光度测量的误差

  30. 1 )非单色光引起的偏移 复合光由l1和l2组成,对于浓度不同的溶液a和b,引起的吸光度的偏差不一样,浓度大,复合光引起的误差大,故在高浓度时线性关系向下弯曲。

  31. 2) 物理化学因素 非均匀介质 胶体,悬浮、乳浊等对光产生散射,使实测吸光度增加,导致线性关系上弯 化学反应 离解、缔合、异构等 如:Cr2O72-+H2O=2HCrO4-=2H++2CrO42- PAR的偶氮-醌腙式 3) 浓度过高

  32. 11.5 吸光光度分析方法 1.经典光度分析法 一、校准曲线法 在确定的最佳显色反应条件 和最佳测量条件下,分别测 定一系列的不同浓度的标准 溶液的吸光度,绘制A-C曲线。

  33. 二、示差吸光光度法 目的:提高光度分析的准确度和精密度;解决高(低) 浓度组分(i.e. A在0.2~0.8以外)问题 分类:高吸光度示差法、低吸光度示差法、 精密示差吸光度法 特点: 以标准溶液作空白 原理: A相对= A = bcx- bc0= b c 准确度:读数标尺扩展, 相对误差减少, c0愈接近cx, 准确度提高愈显著。

  34. 三、解联立方程法 目的:对多组分的吸光物质的含量进行同时测定; 原理:吸光度的加和性 Aλ1= Ax,λ1 + A y,λ1 = x, λ1 bcx +  y, λ1 bcy Aλ2= Ax,λ2 + A y,λ2 = x, λ2 bcx +  y, λ2 bcy

  35. 2.双波长吸光光度法 目的:解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰 多组分同时检测 原理: A = Aλ1 -A λ2 = ( λ1 -  λ2)b c 波长对的选择:等吸光度点法

  36. 例,苯酚与2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中苯酚(x)的双波长分光光度法测定。例,苯酚与2,4,6-三氯苯酚(y)混合物中苯酚(x)的双波长分光光度法测定。 选l1为参比波长, l2为测量波长 得 Al1=  xl1bcx + yl1bcy Al2= xl2bcx+ yl2bcy ΔA=Al2-Al1= (xλ2bcx+yl2bcy)-(xl1bcx+yl1bcy) 在等吸光度的位置(G, F), yl2= yl1,则上式为 ΔA=(xl2- xl1)bcx ΔA与cx成正比, 可用于测定

  37. AB- - A [H+][B-] pKa=pH+ lg Ka= A- AHB [HB] AB- - A lg A- AHB 11.6 吸光光度法的应用 1 测定弱酸和弱碱的离解常数 HB =H+ + B- [HB] pKa=pH+ lg [B-] AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度,它们此时分别全部以[HB]或[B-]形式存在。 对pH作图即可求得pKa

  38. 2 络合物组成确定 饱和法(摩尔比法) 制备一系列含钌3.0×10-5 mol/L (固定不变)和不同浓度(小于12.0×10-5 mol/L)的PDT溶液,按实验条件,485nm测定吸光度,作图。 PDT:Ru=2:1

  39. 等摩尔连续变化法 固定[M]+[L],改变[M],获得一系列吸光度值,吸光度最大的值所对应的[M]与[L]的比值,即获得M:L比值。 Co(III)与3,5-二氯-PADAT的比值为1:2

  40. [MLn] K= [M][L]n 平衡移动法 固定[M],不断改变[L],以lg[MLn]/[M]为纵坐标,lg[L]为横坐标,作图,斜率n即是络合物中L:M的比值;纵轴上的截距lgK是络合物的稳定常数。 lgK+nlg[L]=lg([MLn]/[M]) lgK+nlg[L]=lgA/(Amax-A)

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