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Sobre este proyecto

La creación de capacidades para el desarrollo de nuevos compuestos terapéuticos para la enfermedad de Chagas en El Salvador . JICA - JSPS - MINED 06/08/2011 - 05/08/2013.

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  1. La creación de capacidades para el desarrollo de nuevos compuestos terapéuticos para la enfermedad de Chagas en El Salvador. JICA - JSPS - MINED 06/08/2011 - 05/08/2013

  2. Este proyecto con CICES(MINED) y JICA tiene como objetivo general aumentar la capacidad de investigación básica para encontrar un nuevo compuesto. El período es del día 06 de agosto de 2011 al 05 de agosto de 2013. Para el tratamiento de la enfermedad de Chagas hay que desarrollar un nuevo fármaco para lo que se necesita encontrar un compuesto. Sobre este proyecto

  3. Generalmente, hay dos maneras: 1. Encontrar un compuesto para el tratamiento de Trypanosoma cruzi (T. cruzi). → Este método, después de encontrar un compuesto, hay necesidad de asegurarse de que haya un efecto sobre T. cruzi. 2. Encontrar una enzima decidida de antemano. → Este método, si la enzima está únicamente en T. cruzi , las reacciones adversas pueden ser reducidas en las personas. Sobre este proyecto

  4. 1. Preparar un ambiente de cultivo para T. cruzi, y aprender el subclutivo. Aprender el método experimental para determinar el efecto del reactivo sobre el T. cruzi. 2. Aprender el manejo de la enzima y la purificación a gran escala de la TcDHOD, la cual es una proteína diana, decidido de antemano. Aprender el método experimental para confirmar el efecto del reactivo sobre la TcDHOD(experimentos de inhibición). 3. Preparar el ambiente del laboratorio de cada trabajo. Y lo que maneja cada una de las investigadoras. Objetivos específicos:

  5. La proteína diana TcDHOD (dihidroorotato deshidrogenasa) es una enzima esencial para el crecimiento de T. cruzi. Cuando se inhibe la actividad, T. cruzi se muere. Por eso, TcDHOD es necesaria para que T. cruzipueda vivir. Sobre TcDHOD

  6. Estructura dimérica de TcDHOD Enzima citplasmática C N DHO FMN FMN DHO N C Inaoka et al., Biochemistry, 47, 10881-10891, 2008

  7. La proteína diana TcDHOD (dihidroorotato deshidrogenasa) es una enzima esencial para el crecimiento de T. cruzi. Cuando se inhibe la actividad, T. cruzi se muere. Por eso, TcDHOD es necesaria para que T. cruzipueda vivir. Sobre TcDHOD

  8. La preparación del ambiente del laboratorio del CICES se hace en cooperación con Ministerio de Educación(MINED). Para la instalación del laboratorio, MINED ha asegurado para CICES un espacio en CENSALUD de UES. La preparación del ambiente de laboratorio y el trabajo de los experimentos se realizan en paralelo. Ambiente del Laboratorio

  9. Ambiente del laboratorio Laboratorio de CICES

  10. 1. Cultivar T. cruzi en forma de epimastigote y realizar el experimento de inhibición. 2. Experimentos con la proteína(enzima) TcDHOD. Manejo de la expresión y purificación de la TcDHOD. 3. Manejo de genes. Esto es extracción de gen y manejo del PCR. Los experimentos

  11. 1. Experimento de T. cruzi

  12. 1. Experimento de T. cruzi Método de cultivo de T. cruzi epimastigote. T. cruzi CL Brener es un tipo de cepa de T. cruzi. He traído el epimastigote de Japón. （図：NCBI gene）

  13. 1. Experimento de T. cruzi Hacer el medio: LITmedio pH 7.2 La esterilización se debe hacer usando un filtro.Composición:Infusión de Caldo de Hígado, Triptosa, NaCl, Na2HPO4, KCl, Glucosa, Suero Bovino Fetal y Haemin.

  14. 1. Experimento de T. cruzi El cultivo se hace a25 grados centígrados. Esto se debe a que es la temperatura aproximada del cuerpo de la chinche. T. cruziepimastigote

  15. 1. Experimento de T. cruzi Método de subcultivo: → contar las células Cámara de recuento

  16. 1. Experimento de T. cruzi MII-6-040 Experimentos de inhibición El experimento de inhibición, se ha hecho con unos compuestos que he traído de Japón. MII-5-170

  17. 1. Experimento de T. cruzi Método：Determinar crecimiento en 24 horas después de la adición.

  18. 1. Experimento de T. cruzi Resultado：Determinar crecimiento en 24 horas después de la adición. (Trabajo de Karla y Maricela)

  19. 2. Experimento con la proteína

  20. Método de expresión TcDHOD: Escherichia coli TcDHODesutilizadapara la expresión del TcDHOD, la traje de Japón. sin His tag y con His tag Para expresar la proteína siempre se utiliza E. coli. 2. Experimento de la proteína

  21. BL21(DE3)/pTcDHODCultivo en 200 mL de LB medio La inducción por IPTG 1 mM 25℃ (1) sonicación 21882 x g, 10 min, R.T (2) Sobrenadante (citoplasma) (3) DEAE Sepharose Fast Flow (4) Phenyl Sepharose High Performance (4) kDa 50 40 30 2. Experimento de la proteína (4) Muestra el resultado de la columna de Phenyl.12% SDS-PAGE, Tinción de Azul de Coomassie. Peso molecular del TcDHOD es de 34 kDa. (Trabajo de Karla y Maricela) El flujo del experimento es como este gráfico.

  22. El Resultado de la actividad de TcDHOD a través de la columna Phenyl HP. 2. Experimento de la proteína Abs. La actividad de TcDHOD 32.1 mg /min / ml (Trabajo de Karla y Maricela)

  23. BL21(DE3)/pTcDHOD con His tag.Cultivo en 200 mL de LB medio La inducción por IPTG 1 mM 25℃ (1) sonicación 21882 x g, 10 min, R.T (2) Sobrenadante (citoplasma) (3) DEAE Sepharose Fast Flow (4) His Trap Fast Flow (4) kDa 50 40 30 2. Experimento de la proteína (4) Muestra el resultado de la columna de His Trap FF.12% SDS-PAGE, Tinción de Azul de Coomassie. (Trabajo de Karla y Maricela)

  24. Experimentos de inhibición El experimento de inhibición, se ha hecho con unos compuestos que he traído de Japón. MII-6-040 2. Experimento de la proteína MII-5-170

  25. 3. Manejo de los genes

  26. 3. Manejo de los genes Manejo del PCR. Primer para TcDHODlo he traído de Japón.

  27. 3. Manejo de los genes La electroforesis con agarosa Confirmar en el UV

  28. El laboratorio de CICES tiene capacidad para cultivar T. cruzi y microbio, para trabajar proteína y gen. En otras palabras, podemos hacer el experimento básico y el diagnóstico genético. En el futuro, hay experimentos que se considerarán para desarrollar más investigaciónes. Plan de acción

  29. 1. Confirmar el efecto de inhibición utilizando extracto y compuestos o sintetizados que se obtenengan El Salvador que se necesiten para el desarrollo del nuevo fármaco. Si hay una muestra que tiene posibilidad de efecto, se puede purificar. Y, si una muestra purificada es efectiva, se identifica el compuesto. ¿Compuesto? Plan de acción

  30. Si se encuentra el compuesto terapéutico, hay muchas posibilidades de desarrollo de nuevo compuesto. ¿Compuesto? ↓ Medicina Plan de acción

  31. 2. Uso del PCR Hacemos extracción del gen, y utilizamos el PCR para aplicar a los estudios, los análisis clínicos y epidemiológicos. En este momento, MINSAL y CICES trabajan un proyecto de Chagas en conjunto. Esta tecnología debería ser de beneficio para los pacientes. Plan de acción

  32. El laboratorio de CICES tiene capacidad para hacer desde el experimento básico al epidemiológico. Desde ahora, me gustaría trabajar en colaboración con el MINSAL y otras instituciones de investigación junto con el laboratorio de CICES para beneficio de todos. Y con el tiempo, deseo que la investigación básica sea conjunta. Puede ser a nivel de toda la región centroamericana, siendo El Salvador el eje principal. Conclusión

  33. ¡Muchas Gracias!

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