1 / 21

PRACTICAS EN BIOQUIMICA Cuantificación de Proteínas

PRACTICAS EN BIOQUIMICA Cuantificación de Proteínas. METODOS COLORIMETRICOS BIURET LOWRY BRADFORD BCA Otros métodos: ABSORBANCIA (UV). Cuantificación de Proteínas por Métodos Colorimétricos. El uso de un determinado método colorimétrico depende de:

velvet
Télécharger la présentation

PRACTICAS EN BIOQUIMICA Cuantificación de Proteínas

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. PRACTICAS EN BIOQUIMICA Cuantificación de Proteínas

  2. METODOS COLORIMETRICOS • BIURET • LOWRY • BRADFORD • BCA • Otros métodos: ABSORBANCIA (UV)

  3. Cuantificación de Proteínas por Métodos Colorimétricos • El uso de un determinado método colorimétrico depende de: • Pureza de la muestra: presencia de otras proteínas, detergentes, agentes reductores • Cantidad de proteína: límite de detección del método • Disponibilidad de equipo, costo.

  4. Método de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949 • Reacción de sales de Cu+2 con moléculas que contienen más de dos enlaces peptídicos en un medio alcalino; el Cu+2 es reducido a Cu+1 formando complejos color púrpura que tienen un máximo de absorción a 540 nm. El método se usa para soluciones que tienen de 0.5 a 10 mg proteína/ml o más. • Es un método poco sensible. Es útil cuando se quiere analizar grandes lotes de proteína. • Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como tioles y sales de amonio, que pueden removerse precipitando la proteína con un volumen igual de ácido tricloroacético al 10%, resuspendiendo el precipitado que contiene las proteínas en NaOH 1 N.

  5. Método de LowryLowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951 • Es un método más sensible que el de Biuret pudiendo detectar muy bajas concentraciones (hasta 5 ug). • El principio de la detección es el mismo que el de Biuret.Diferencia: se utiliza un segundo reactivo: la solución de Folin– Ciocalteau (fosfomolíbdato-fosfotungstato) en un medio cúprico alcalino, el cual se le agrega para incrementar la intensidad del color. • Este incremento en la intensidad se debe a la reducción del reactivo Folin– Ciocalteau por los residuos de tirosina y triptofano presentes en las proteínas. • Producto coloreado leído en espectofotómetro a 750 nm.

  6. Interferencias (Lowry) Most phenols, except nitrophenols, reduce the reagent; therefore thymol and to a lesser degree sulfosalicylic acid interfere, Glycine (0.5 per cent) decreases the color with protein by 50 per cent.

  7. Método de BradfordBradford, M. M. (1976) Anal. Biochem.72, 248 • El método de Bradford de basa en que el Azul Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul, al unirse a residuos aromáticos y arginina en las proteínas. • El complejo proteína-colorante tiene un coeficiente de extinción elevado, lo que le confiere gran sensibilidad. • Cambio de 495nm a 595 nm.

  8. Coomasie Brilliant Blue G-250 (utilizado en el método de Bradford)

  9. Ventajas: • Reacción rápida (aproximadamente 2-5 min) • El completo proteína-colorante se mantiene por un tiempo relativamente largo (1 hora) • Rango de detección: 1 -20 ug. Desventajas: • Algunas interferencias : detergentes (Triton X-100 y SDS) • Variación entre diferentes proteínas

  10. Bicinchoninic acid (BCA) assay • Similar al método de Lowry • Formación del complejo Cu2+-proteina bajo condiciones alcalinas, seguida de la reducción de Cu2+ to Cu1+ (Cys, Trp, Tyr y enlaces peptídicos) • BCA forma un complejo azul-púrpura con el Cu1+ (formado en medio alcalino) • Lectura de absorbancia a 562 nm.

  11. Ventajas del método BCA: • Mas sensible que Lowry & Biuret • No tiene tanta variación como el método de Bradford • Color estable • Menos susceptible a detergentes

  12. A. Método de Biuret: Concentración de BSA Stock = 28 mg/ml. 1.- Preparar 9 tubos según la tabla a continuación:

  13. 2- Agregar 1,5 ml del reactivo de Biuret y mezclar por agitación. 3- Incubar por 10 minutos a 37ºC. 4- Leer en el espectrofotómetro a 540 nm. 5- Anotar los resultados y graficar.

  14. B. Método de Bradford: Concentración de BSA Stock = 0.25 mg/ml. 1.- Preparar 8 tubos eppendorf según la tabla a continuación:

  15. 2- Colocar en un tubo de ensayo de vidrio 800 uL de cada mezcla. 3- Adicionar 200 uL del Reactivo de Bradford concentrado, mezclar por agitación. 4- Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. 5- Leer en el espectrofotómetro a 595nm. 6- Anotar los resultados y graficar.

  16. C. Método de Lowry: Concentración de BSA Stock = 2 mg/ml. 1.- Preparar 9 tubos eppendorf según la tabla a continuación:

  17. En un frasco de vidrio color ambar preparar el Reactivo 1 mezclando las siguientes soluciones en proporción 100:1:1, respectivamente: • Solución A: Carbonato de sodio (Na2CO3) al 2% en agua destilada • Solución B: Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 5H2O) al 1% en agua destilada • Solución C: Tartrato sodio potasio tetrahidratado al 1% en agua destilada. 2.- Colocar en un tubo de ensayo 100 uL de mezcla. 3.- Adicionar 100 uL de NaOH 2N a cada tubo e hidrolizar a 100°C por 10 minutos en un Hot Plate o Agua hirviendo. 4.- Dejar que la muestra hidrolizada enfríe a temperatura ambiente por 5 minutos 5.- Agregar 1000 uL de Reactivo 1 (Reactivo de Biuret modificado) a cada tubo, dejar reaccionar por 10 minutos a temperatura ambiente. 6.- Agregar 100 uL de Reactivo 2 (Fenol Folin-Ciocalteu), mezclar en el vortex y dejar reaccionar a temperatura ambiente por 30 minutos. 7.- Leer en el espectrofotómetro a 750 nm. 8.- Anotar los resultados y graficar

  18. 1. Biuret : Todos los grupos 2. Bradford : Todos los grupos 3. Lowry: 2 grupos (iniciar con este experimento)

  19. Absorción Ultravioleta de las Proteínas • Todas las proteínas absorben fuertemente debajo de 230 nm. Por ejemplo, la albúmina sérica bovina (0.1% p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215, respectivamente (comparado con 0.66 a 280 nm). La absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptídico. • Consecuentemente los valores de A 0.1% son casi los mismos para todas las proteínas. Concentraciones de proteínas en el rango de 10 a 100 ug/ml pueden determinarse de la diferencia de absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva standard graficando A vs. proteínas. (proteína)ug/ml = 144 (Acm215 - Acm225) • La diferencia de absorbancia es usada para minimizar errores que resulten de compuestos no proteicos en solución. Altas concentraciones de ciertos buffers pueden interferir (no se puede usar 0.1 N NaOH para disolver la proteína, pero 5 mM NaOH no causa problemas).

More Related